本发明公开了一种bet/hdac双靶点抑制剂及其制备方法和应用，属于医药化工
技术领域：
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背景技术：
：许多人类疾病特别是肿瘤及自身免疫炎症的一个重要特征就是乙酰化水平异常从而导致转录异常。组蛋白赖氨酸的乙酰化水平主要由组蛋白乙酰化转移酶(hats)、组蛋白去乙酰化酶(hdacs)和溴结构域蛋白(brd)控制。brd是一类能够特异性识别组蛋白乙酰化赖氨酸(acetylatedlysine,kac)的蛋白结构域。人体内发现的61种brd存在于46种蛋白中，根据其功能的不同，被划分为8大家族，其中溴结构域和超末端结构蛋白(bromodomainandextraterminaldomain，bet)属于brd家族的第2类，包括brd2、brd3、brd4和brdt。bet蛋白通过识别乙酰化赖氨酸(kac)，并招募不同的转录调节因子，如正性转录延伸因子b(p-tefb)来调节靶基因的表达。bet抑制剂在临床研究中呈广谱性，在抗肿瘤、抗炎及男性避孕等方面均有疗效。bet家族作为表观遗传领域的重要抗肿瘤靶标，近年来日益受到制药公司和科研机构的高度关注。hdacs是多蛋白质复合物的催化亚单位，hdac介导核小体结构的改变，参与调节基因表达，调节细胞周期进程和分化。多种疾病如癌症、急性骨髓性白血病、感染等的发生与发展都与hdac有关。一般情况下，组蛋白乙酰化水平与基因转录活性呈现正相关关系。通过对组蛋白去乙酰化的抑制作用，可以导致染色质过乙酰化，从而促进癌细胞的基因活化，导致细胞分化或死亡。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitors，hdac抑制剂)可以通过与hdac活性催化口袋底部的锌离子进行相互作用，可逆或者不可逆的抑制组蛋白去乙酰化酶活性，从而阻断了因hdac功能紊乱而导致的有关抑癌基因表达受抑制。目前，基于乙酰化体内动态平衡的新药研发主要集中在组蛋白去乙酰化酶抑制剂，然而组蛋白乙酰化转移酶与溴结构域在调控组蛋白乙酰化的内稳态上也起到关键作用，这也就提供了新的新药研发思路。溴结构域是一种能够特定识别组蛋白乙酰化赖氨酸残基的蛋白结构域，例如组蛋白拖尾上n末端的赖氨酸残基。这种特定的识别是调节蛋白与组蛋白的结合以及染色结构重塑的先决条件。同时，肿瘤的发生常常涉及多个抑癌基因的失活，针对单一基因的治疗往往不足以抑制肿瘤的生长，bet及hdac作用于整个基因组而不是特定的基因，可同时恢复多个抑癌基因的表达提高基因组稳定性。目前，已报道了多种结构各异的选择性靶向bet的小分子抑制剂，它们都可以特异性的靶向乙酰化赖氨酸(kac)识别位点，在该位点与kac竞争保守的天冬酰胺残基140(asn140)。bi-2536是一种目前处于二期临床的激酶抑制剂，同时对bet蛋白有很高的抑制活性，对brd4的ic50值为25nm，作为化学探针成功证实bet可作为潜在的抗肿瘤治疗靶点。值得关注的是，对brd4的抑制作用将导致转录因子myc家族致癌基因(如c-myc)的下调，c-myc在多种肿瘤细胞中高表达且发挥关键作用。目前为止，能够直接抑制c-myc的小分子抑制剂还未见报道，因此brd4抑制剂可为c-myc高表达引起的肿瘤疾病提供新的治疗策略。目前并未有bet/hdac双靶点的bi-2536衍生物抑制剂的报道。技术实现要素：发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种bet/hdac双靶点抑制剂及其制备方法和应用，该双靶点抑制剂为上述bi-2536化合物的衍生物。技术方案：本发明提供了一种bet/hdac双靶点抑制剂，其结构如下所示：其中，n＝2～6。优选，n＝2～5。优选，n＝2～4。本发明还提供了所述的bet/hdac双靶点抑制剂的制备方法，反应过程如下所示：式15所示化合物即为所述bet/hdac双靶点抑制剂；其中，式10、式11、式12、式14和式15中，n＝2-6。优选，在缩合剂和碱存在下，式9化合物与式10化合物反应，获得式11化合物。优选，式11化合物与碱反应，获得式12化合物。优选，在缩合剂和碱存在下，式12化合物与式13化合物反应，获得式14化合物。优选，用酸脱去式14化合物的叔丁氧基，即可获得所述的式15化合物。更优选地：由式9化合物合成式11化合物时，反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自正丁醇、叔丁醇、二氧六环、苯、甲苯、乙苯、叔丁苯、二甲苯、n,n-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种或几种。此外，缩合剂为hbtu、hctu或hobt，碱选自叔丁醇钾、二异丙基氨基锂、n,n-二异丙基乙胺、三乙胺和二异丙胺中的一种或几种。反应温度为23～110℃，反应时间为1～24h，反应温度为23～40℃，反应时间为12～18h，更优选的，反应温度为23℃，反应时间为16h。由式11化合物合成式12化合物时，反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自二氯甲烷、二氯乙烷、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、甲苯、n,n-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇和二氧六环中的一种或几种；碱为氢氧化钠；碱的质量浓度为10～30％，优选为20％。反应温度为80～120℃，反应时间为1～10h，优选的，反应温度为90～110℃，反应时间为1～4h，更优选的，反应温度为100℃，反应时间为2h。由式12化合物合成式14化合物时，反应在有机溶剂中进行，有机溶剂选自正丁醇、叔丁醇、二氧六环、苯、甲苯、乙苯、叔丁苯、二甲苯、n,n-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种或几种。此外，缩合剂为hbtu、hctu或hobt，碱选自叔丁醇钾、二异丙基氨基锂、n,n-二异丙基乙胺、三乙胺和二异丙胺中的一种或几种。反应温度为23～110℃，反应时间为1～24h，反应温度为23～40℃，反应时间为12～18h，更优选的，反应温度为23℃，反应时间为16h。由式14化合物合成式15化合物时，式14化合物溶于有机溶剂中，加酸反应，反应结束后，从体系中分离得到所述的式15化合物。所述的酸选自盐酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、乙磺酸、三氟甲磺酸、磷酸和硫酸氢钠水溶液中的一种或几种。所述有机溶剂选自二氯甲烷、正丁醇、叔丁醇、二氧六环、苯、甲苯、乙苯、叔丁苯、二甲苯、n,n-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的一种或几种。反应一般在室温中进行即可，反应时间为1-12h，优选为1～4h，更优选为2h。其中，式9化合物为bi-2536中间体，可采用现有公开的方法进行制备，示例如下：本发明最后提供了所述的bet/hdac双靶点抑制剂在制备bet酶或/和hdac酶抑制药物中的应用。实验证明，本发明bet/hdac双靶点抑制剂具有bet酶和hdac酶抑制活性，且一些化合物较原各自单靶点抑制剂的抑制活性更高，因此，可将其应用于bet酶或/和hdac酶抑制药物的制备中。此外，还提供了所述的bet/hdac双靶点抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。实验证明，本发明bet/hdac双靶点抑制剂对肿瘤细胞，如白血病细胞具有较好的抑制作用，因此，可将其应用于抗肿瘤药物的制备中。图1以一种化合物为例展示了本发明抑制剂设计的药效结构模型，本发明以bi-2536出发，在其适当位置引入适当的侧链连接hdac的zn2+螯合基团(邻氨基苯甲酰胺)，一方面没有影响本发明双靶点抑制剂与bet的kac识别位点的结合；同时，bi-2536母核作为hdac抑制剂的表面识别部分，也未影响邻氨基苯甲酰胺与hdac蛋白zn2+的螯合。bet酶抑制活性测定药理实验的结果表明：bet/hdac双靶点抑制剂较单靶点bet抑制剂具有更好的bet酶抑制活性，其中化合物bi-c的抑制活性最高。hdac酶抑制活性测定药理实验的结果表明：bet/hdac双靶点抑制剂较单靶点hdac抑制剂具有更好的hdac酶抑制活性，其中化合物bi-c的抑制活性最高。u937细胞存活率测定药理实验的结果表明：本发明的bet/hdac双靶点抑制剂bi(a-e)较传统的单靶点bet抑制剂以及单靶点hdac抑制剂的抗肿瘤细胞活性更高，其中化合物bi-c的抗肿瘤细胞活性最高。技术效果：相对于现有技术，本发明通过linker将bet抑制剂(bi-2536)与hdac抑制剂(vorinostat)的活性药效团进行拼接，同时保留了bet酶和hdac酶抑制活性，得到了一类具有bet/hdac双靶点抑制活性的新型抑制剂。本发明的制备方法简单，条件温和，产率高。bet及hdac作用于整个基因组而不是特定的基因，可同时恢复多个抑癌基因的表达提高基因组稳定性。bet/hdac双靶点抑制剂提供了一个全新的新药研发思路，提高了药物的利用效率和治疗效果，对实体肿瘤的抑制有可能取得实质性的进展。附图说明图1为基于bi-2536和hdac药效团的双靶点抑制剂的设计思路。具体实施方式下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。本发明提供的bet/hdac双靶点抑制剂合成路线如下：meoh：甲醇；dcm:二氯甲烷；acetone：丙酮；iron：铁粉；acoh:冰醋酸；mei:碘甲烷；dmf：n，n-二甲基甲酰胺；ethanol：乙醇；thf：四氢呋喃；tfa:三氟乙酸；vorinostat：伏立诺他，n-羟基-n'-苯基辛二酰胺；entinostat：恩替诺特，n-[[4-[[(2-氨基苯基)氨基]甲酰]苯基]甲基]氨基甲酸3-吡啶基甲基酯。实施例1下面以15c(bi-c)的合成为例，进一步阐明本发明：1、制备化合物2，反应式如下：称取化合物1(1g，9.96mmol)溶于10ml甲醇中，0℃冰水浴条件下缓慢加入氯化亚砜(1.48ml，20.36mmol)，65℃回流1.5h，反应结束后减压蒸馏。剩余油状物与10ml甲基叔丁基醚混合搅拌0.5h，所得无色晶体过滤、乙醚洗涤、真空干燥过夜，得无色半固态晶体即目标化合物2(1.12g，quant.)。目标产物化合物2的1hnmr的数据如下：1hnmr(300mhz，cdcl3)δ:8.71(s，2h)，4.20-4.01(m，1h)，3.66(s，3h)，2.24-2.02(m,2h)，1.09(t，j＝7.0hz，3h)。2、制备化合物4，反应式如下：称取化合物2(1g，8.54mmol)，环戊酮(582μl，6.58mmol)，用11ml二氯甲烷溶解。0℃冰水浴条件下加入无水乙酸钠(539mg，6.58mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(2.03g，9.57mmol)。室温反应16h，加入15ml20％碳酸氢钠溶液，二氯甲烷萃取3次，合并有机相，水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏，得淡黄色油状物即化合物4(1.18g，产率为97％)。目标产物化合物4的1hnmr的数据如下：1hnmr(300mhz，cdcl3)δ:3.71(s,3h)，3.19(t，j＝6.6hz，1h)，2.99-2.93(m，1h)，2.13(s，3h)，1.81-1.54(m，7h)，1.52-1.46(m，2h),1.29(dt，j＝11.7hz,2h),0.91(t，j＝7.4hz，3h)。3、制备化合物6，反应式如下：将化合物4(572mg，3.09mmol)和无水碳酸钾(426mg，3.09mmol)加入到10ml丙酮中，冰水浴条件下，缓慢加入5ml丙酮溶解的化合物5(635mg，3.27mmol)。室温反应16h，点板确定反应结束，减压蒸馏。乙酸乙酯萃取两次，水洗，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏。混合物柱层析得黄色化合物6(527mg，产率为50％)。目标产物化合物6的1hnmr的数据如下：1hnmr(300mhz，cdcl3)δ:8.65(s,1h),3.78-3.74(m,4h),3.60-3.52(m,1h),3.48-3.36(m,1h),2.25-2.14(m,1h),2.02-1.81(m,2h),1.76-1.51(m,6h),1.05(t,j＝7.5hz,3h)。4、化合物7的制备，反应式如下：将化合物6(520mg，1.52mmol)溶解在5ml冰醋酸中，70℃时分批加入104mg还原铁粉。70℃搅拌反应1h，然后升温至100℃，反应1.5h。反应完混合物通过硅藻土过滤，减压蒸馏，柱层析得黄色化合物7(128mg，30％)目标产物化合物7的1hnmr的数据如下：1hnmr(300mhz，cdcl3)δ：9.8(s,1h),7.73(s,1h),4.34-4.27(m，1h)，4.21(dd，j＝4.41hz，2.07hz,1h),2.1-2.04(m,1h),1.98-1.86(m,5h),1.81-1.75(m,2h),1.67-1.64(m,2h),0.93(t,j＝4.5hz,3h)。5、化合物8的制备，反应式如下：例5-1称取化合物7(280mg，1mmol)溶解在5mln,n-二甲基甲酰胺溶液中，加入碘甲烷(80μl，1.3mmol)，反应降温至-10℃，加入60％分散在矿物油中的氢化钠(52mg，1.3mmol)0℃反应30min，升至室温反应3h，点板确定反应结束，加入碎冰终止反应。乙酸乙酯萃取两次，水洗，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏，柱层析得淡黄色化合物8(294mg，quant.)目标产物化合物8的1hnmr的数据如下：1hnmr(300mhz，cdcl3)δ:7.67(s,1h),4.38-4.30(m,1h),4.24(dd,j＝7.47hz,3.6hz,1h),3.33(s,3h),2.08-2.02(m,1h)。例5-2称取化合物7(280mg，1mmol)溶解在5ml四氢呋喃溶液中，加入碘甲烷(80μl，1.3mmol)，反应降温至-10℃，加入60％分散在矿物油中的氢化钠(52mg，1.3mmol)0℃反应30min，升至室温反应3h，点板确定反应结束，加入碎冰终止反应。乙酸乙酯萃取两次，水洗，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸馏，柱层析得淡黄色化合物8(235mg，产率为80％)6、化合物9的合成，反应式如下：称取化合物8(235mg，0.8mmol)和4-氨基-3-甲氧基苯甲酸(208mg，1.24mmol)加入0.6ml乙醇、2.4ml水、260μl浓盐酸混合溶剂中，反应混合物95℃回流48h。减压蒸馏，柱层析得化合物9(170mg，产率为50％)目标产物化合物9的1hnmr的数据如下：1hnmr(300mhz，dmso)δ:12.5(s,1h),8.5(s,1h),7.85(s,1h)7.68(s,1h),7.58(dd,j＝8.46hz,1.53hz,1h),7.49(s,1h)4.35(t,j＝8.1hz,1h),4.26-4.22(m,1h),3.94(s,3h),3.25(s,3h)2.09-1.61(m,10h),0.76(t,j＝7.35,3h)。7、化合物11c的合成，反应式如下：称取化合物9(425mg，1mmol)溶解在dmf中，冰浴下缓慢加入hctu和n,n-二异丙基乙胺(0.72ml，4.0mmol)，反应30min后加入化合物10c(157.4mg，1.2mmol)，混合物在室温下搅拌反应16h，乙酸乙酯萃取两次，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏。混合物柱层析得化合物11c(447mg，产率为83％)目标产物化合物11c的1hnmr的数据如下：1hnmr(300mhz，cdcl3)δ:8.89(s,1h),8.64(s,1h),8.27(s,1h)，7.45(s,1h),7.36-7.33(m，3h),3.86(s,3h)，3.61(s，3h),3.47-3.42(m,4h),3.35-3.3(m,2h),2.67-2.64(m,1h),2.35-2.32(m,2h),1.77-1.56(m，14h)，0.86(t,j＝7.35hz,3h)。8、化合物12c的合成，反应式如下：称取化合物11c(538.7mg，1mmol)溶解在乙醇中，加入200ml质量浓度为20％的naoh水溶液，加热到100℃，高温回流2h。反应结束后，冷却至室温，加入1m盐酸，调节ph至6-7，乙酸乙酯萃取三次，水洗，得到化合物12c(472.2mg，产率为90％)。目标产物化合物12c的1hnmr的数据如下：1hnmr(300mhz，cdcl3)δ:11.87(s，1h),8.89(s,1h),8.64(s,1h),8.27(s,1h),7.45(s,1h),7.36-7.33(m,2h),3.86(s,3h),3.47-3.42(m,4h),3.3(s,2h),2.64(s,1h),2.27-2.21(m,2h),1.77-1.52(m,14h),0.86(t,j＝7.4hz,3h)。9、化合物14c的合成称取化合物12c(524.6mg，1mmol)溶解在dmf中，冰浴下缓慢加入hctu和n,n-二异丙基乙胺(0.72ml，4mmol)，反应30min后加入化合物13(250mg，1.2mmol)，室温下搅拌反应16h，点板确定反应结束，乙酸乙酯萃取两次，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，柱层析得化合物14c(536.2mg，产率75％)。目标产物化合物14c的1hnmr的数据如下：1hnmr(300mhz，cdcl3)δ:10.02(s，1h),9.86(s,1h),8.85(s,1h),8.6(s,1h),8.27(s,1h),7.93-7.91(m,2h),7.4-7.23(m,5h),3.86(s,3h),3.47-3.3(m,6h),2.67-2.64(s,1h),2.35-2.32(m,2h),1.73-1.49(m,23h),0.84(t,j＝7.4hz,3h)。10、化合物15c(化合物bi-c)的合成称取化合物14c(714.9mg，1mmol)，溶解在二氯甲烷溶液中，冰浴下缓慢加入三氟乙酸10ml，升至室温继续反应2h。点板确定反应结束，乙酸乙酯萃取两次，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，柱层析得化合物15c(528.7mg，产率86％)。目标产物化合物bi-c的1hnmr的数据如下：1hnmr(500mhz，dmso)δ：9.98(s，1h),8.81(s,1h),8.58(s,1h),8.27(s,1h),7.66-7.6(m,1h),7.45-7.33(m,4h),7.0-6.85(m,2h),5.12(s,2h),3.82(s,3h),3.47-3.42(m,4h),3.35-3.24(m,2h),2.68-2.6(m,1h),2.37-2.3(m,2h),1.85-1.56(m,14h),0.88(t,j＝7.4hz,3h)。实施例2按照实施例1的方法，将化合物10c替换为10a，试验参数进行常规调整，得到最终产物15a(bi-a)。实施例3按照实施例1的方法，将化合物10c替换为10b，试验参数进行常规调整，得到最终产物15b(bi-b)。实施例4按照实施例1的方法，将化合物10c替换为10d，试验参数进行常规调整，得到最终产物15d(bi-d)。实施例5按照实施例1的方法，将化合物10c替换为10e，试验参数进行常规调整，得到最终产物15e(bi-e)。实施例6brd4酶抑制活性评价实验化合物：本发明所述新型bet/hdac双靶点bi-2536衍生物抑制剂bi-a、bi-b、bi-c、bi-d、bi-e以及阳性对照化合物(+)-jq1、bi-2536。试剂盒：人brd4酶联免疫分析试剂盒操作步骤：1、标准品的稀释：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。2、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3、温育：用封板膜封板后37℃温育30分钟。4、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。5、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5次，拍干。6、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7、温育：操作同3。8、洗涤：操作同5。9、显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。10、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。11、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。所有实验数据均经统计处理。实验结果如表1所示，结果表明新型bet/hdac双靶点bi-2536衍生物抑制剂较单靶点bet抑制剂具有更好的hdac酶抑制活性，其中化合物bi-c的bet酶抑制活性最高。表1化合物抑制bet酶活性数据(ic50nm)化合物ic50值(nm)jq-148.12bi-253637.78bi-a26.34bi-b25.29bi-c23.56bi-d29.55bi-e30.18实施例7hdac酶抑制活性评价实验化合物：本发明所述新型bet/hdac双靶点bi-2536衍生物抑制剂bi-a、bi-b、bi-c、bi-d、bi-e以及阳性对照化合物vorinostat、entinostat。试剂盒：hdac荧光活性分析/药物发现试剂盒(ak-500，biomolresearchlaboratories)。操作步骤：1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。6、显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。所有实验数据均经统计处理。实验结果如表2所示，结果表明新型bet/hdac双靶点bi-2536衍生物抑制剂较单靶点hdac抑制剂具有更好的hdac酶抑制活性，其中化合物bi-c的hdac酶抑制活性最高。表2化合物抑制hdac酶活性数据(ic50nm)化合物ic50值(nm)vorinostat43.13entinostat37.56bi-a30.89bi-b27.77bi-c25.35bi-d28.24bi-e31.92实施例8人急性髓性白血病细胞u937细胞体外活性的测定抑制肿瘤细胞增殖活性研究用mtt法测定所合成化合物在10μm浓度下对人急性髓性白血病细胞u937的生长抑制率。操作步骤：细胞选择和培养：1.打开紫外照射超净台30分钟左右，关闭紫外灯，开风机以及照明灯。2、从液氮罐中取出冻存好的高分化的人急性髓性白血病细胞u937冻存管立即放入准备好的37℃的温水中，并不时地摇动使其完全融化。3、然后移至超净台中进行操作，用吸管吸除解冻后的细胞悬液，加入到离心管中，并用一定量的培养基冲洗冻存管后加到离心管中，低速离心4分钟左右，转速800rpm。4、用吸管吸走上清液，再加一定量的培养基，震荡使得细胞均匀悬浮，并转移至培养瓶中，在37℃的co2培养箱中孵育。药物的mtt试验方法：1、待上述细胞生长到80-90％时，在超净台下用一次性塑料吸管吸走原来的培养液，用pbs冲洗去残留培养基，加入适量胰酶消化细胞，然后加入新的培养液稀释并使细胞悬浮在培养液中。2、重新调整u937细胞悬浮液浓度，使细胞浓度至5×104个/ml左右。3、在96孔板中加入上述计数好的u937细胞，每孔精确在100μl。4、将上述加入细胞的96孔板放在5％的co2培养箱中在37℃条件下孵育24小时，然后吸出培养基，加入溶有浓度梯度药物的培养基，每孔100μl。5、5％co2，37℃孵育，24小时后倒置显微镜下观察，并进行下面操作。6、每孔加入50μl1×mtt溶液，继续培养4h。7、终止培养，小心吸去孔内培养液。8、每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值。9、同时设置调零孔(培养基、mtt、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、mtt、二甲基亚砜)所有实验数据均经统计处理。实验结果如表3所示，结果表明新型bet/hdac双靶点bi-2536衍生物抑制剂较单靶点hdac抑制剂具有更好的抑制肿瘤细胞活性，其中化合物bi-c的肿瘤抑制活性最高。表3.化合物与细胞作用24h细胞存活率(％)化合物细胞存活率(％)control100dmso(10μm)88.67283bi-a(10μm)5.31399bi-a(5μm)10.27118bi-a(3μm)17.32669bi-b(10μm)4.41757bi-b(5μm)13.28505bi-b(3μm)19.35610bi-c(10μm)4.12732bi-c(5μm)9.37511bi-c(3μm)16.12717bi-d(10μm)6.42611bi-d(5μm)11.21015bi-d(3μm)18.10493bi-e(10μm)8.24827bi-e(5μm)15.94783bi-e(3μm)28.37498bi-2536(10μm)10.32363bi-2536(5μm)26.60879bi-2536(3μm)32.22188vorinostat(10μm)8.12989vorinostat(5μm)17.2188vorinostat(3μm)29.64869以上对本发明的特定实施例进行了说明，但本发明的保护内容不仅仅限定于以上实施例，在本发明的所属
技术领域：
中，只要掌握通常知识，就可以在其技术要旨范围内进行多种多样的变更。当前第1页12