海洋芽孢杆菌及其产生脂肽的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，海洋芽孢杆菌(bacillussp.bs176)及其脂肽分子的应用。

背景技术：

生物表面活性剂(biosurfactants)是来源于生命有机体尤其是微生物的一类表面活性物质。根据生物表面活性剂的结构特点,可将其分为:糖脂类、脂肽和脂蛋白类、磷脂和脂肪酸类、聚合表面活性剂类和微粒表面活性剂类等5大类。由于生物表面活性剂生产条件温和、低毒、生物可降解性和环境兼容等特点,成为化学表面活性剂的优良替代品,在工业化生产上具有潜在的应用优势,可用于食品、化妆、制药工业、环境保护和节能工艺等方面[1]。

脂肽(lipopeptide)是一类重要的生物表面活性剂，主要由亲水的氨基酸链和疏水的脂肪酸链组成。目前，大部分的脂肽分子具有较强的抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，因此它们在抗生素开发、环境治理以及食品安全防控等方面具有重要的应用潜力[2]。脂肽分子主要来源于微生物；而其中又以来源于芽孢杆菌(bacillusspp.)的脂肽居多。例如，分离自枯草芽孢杆菌的surfactin、fengycin、iturin、bacillomycin和mycosubtilin；分离自地衣芽孢杆菌的lichenysin以及分离自矮小芽孢杆菌的pumilacidin等[3-5]。尽管已经有多种类型的脂肽分子被发现，但是由于它们种类繁多、结构复杂，大部分脂肽的作用机制仍不明确并且其应用潜力仍十分有限。

我国是水产养殖大国，由于养殖规模的不断扩大和养殖环境的加剧恶化，导致由病原细菌造成的水产动物病害频发。为了减少传统抗生素和化学药物滥用带来的病原细菌耐药性增强以及水产养殖食品安全受到破坏等问题，环境友好型的抗菌活性物质有待于深入开发和广泛的应用。近些年来，随着国家海洋战略的实施和蓝色经济区的发展，推动了我国海洋生物学以及海洋生物技术的深入研究。目前，从海洋生物或海洋沉积物中已经分离出多种能够产生脂肽的微生物,并且所产生的脂肽生物活性显著。这些脂肽分子将在新型抗生素的开发、环境治理以及提高我国水产养殖安全性等领域具有重要的应用前景。

参考文献：

1.侯红漫,靳艳,金美芳,虞星炬,张卫.2006.环脂肽类生物表面活性剂结构、功能及生物合成.微生物学通报.33:122-128.

2.dasp,mukherjees,senr.2008.antimicrobialpotentialofalipopeptidebiosurfactantderivedfromamarinebacilluscirculans.j.appl.microbiol.104:1675-1684.

3.vaterj,kablitzb,wildec,frankep,mehtan,cameotrass.2002.matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometryoflipopeptidebiosurfactantsinwholecellsandculturefiltratesofbacillussubtilisc-1isolatedfrompetroleumsludge.appl.environ.microb.68:6210-6219.

4.yakimovmm,timmiskn,wrayv,fredricksonhl.1995.characterizationofanewlipopeptidesurfactantproducedbythermotolerantandhalotolerantsubsurfacebacilluslicheniformisbas50.appl.environ.microb.61:1706-1713.

5.narusen,tenmyoo,kobarus,kameih,miyakit,konishim,okit.1990.pumilacidin,acomplexofnewantiviralantibiotics-production,isolation,chemical-properties,structureandbiological-activity.j.antibiot.43:267-280.

技术实现要素：

本发明目的在于提供海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176及其产生脂肽的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种海洋芽孢杆菌，产脂肽海洋细菌为bacillussp.bs176，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2016年12月，保藏编号：cgmccno.13515。

一种海洋芽孢杆菌的应用，所述海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176在产生脂肽中的应用。

一种海洋芽孢杆菌的应用，所述海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176在制备抑制病原细菌的药物中的应用。

一种脂肽分子，脂肽分子为子clp1和clp2，clp1分子式为c57h101n7o13，clp2分子式为c58h103n7o13。

所述脂肽分子clp1和clp2多肽部分均由谷氨酸(glu)-亮氨酸(leu)-亮氨酸(leu)-亮氨酸(leu)-天冬氨酸(asp)-亮氨酸(leu)-异亮氨酸(ile)组成，它们的脂肪酸链都为β羟基脂肪酸，区别仅是在脂肪酸链上差一个亚甲基基团(ch2-)。

一种脂肽分子的制备方法，将所述海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176接种到2216e液体培养基中，28℃过夜震荡培养；而后取菌液转接到发酵培养基中，28℃震荡培养2天；发酵结束后，离心收集发酵上清液，上清液经酸化、冷冻干燥以及旋转蒸发得海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176胞外活性物质的粗提物(clps)，而后经进一步的纯化，即得脂肽分子clp1和clp2。

所述发酵培养基为蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖5g/l，海水1l，ph7.5。

所述发酵结束后，8000转/分离心10分钟收集发酵上清液，上清液经酸化、冷冻干燥以及旋转蒸发等处理获得bacillussp.bs176胞外活性物质的粗提物。将粗提物通过sephadexlh-20色谱柱分离有生物活性的馏分。该馏分进一步通过高效液相色谱(hplc，uv241nm)进行了分离和纯化。

通过hplc共分离获得两个具有抑制细菌运动能力活性的单一物质馏分，将这两种活性物质经过一级质谱(esi-ms)和二级质谱(ms/ms)的分析，发现它们的分子量分别为1114.73da和1128.75da，并且它们具有相同的氨基酸组成形式，即由glu-leu-leu-leu-asp-leu-ile组成的环肽结构，并且glu和asp都存在甲氧基的修饰。这两种活性物质进一步经过核磁共振(nmr)的分析发现，它们除了氨基酸链的结构外还存在脂肪酸的结构，说明这个种活性物质均为脂肽分子，并且属于同系物，仅在脂肪酸链的部分相差了一个亚甲基(ch2-)(图1)。

一种脂肽分子的应用，所述脂肽分子clp1和clp2在制备抑制病原细菌的药物中的应用。

所述病原细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。所述病原菌为鳗弧菌、灿烂弧菌、创伤弧菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌或芽孢杆菌bs176等。

本发明所具有的优点：本发明中芽孢杆菌bacillussp.bs176分离自西太平洋海山区域，属于海洋微生物，该菌产生的脂肽具有抑制水产养殖病原细菌运动能力的活性，并且对多种病原细菌具有促进菌体凝集和沉降的作用。该芽孢杆菌及其产生的脂肽在开发广谱抗菌类药物、改善水产养殖环境等方面具有潜在应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例提供的bacillussp.bs176脂肽分子的结构图。

图2为本发明实施例提供的bacillussp.bs176及其脂肽分子抑制溶藻弧菌运动能力的活性图。

图3为本发明实施例提供的bacillussp.bs176的脂肽分子促进溶藻弧菌菌体凝集的活性图。

图4为本发明实施例提供的bacillussp.bs176脂肽分子作用的广谱性图。

具体实施方式

下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

本发明产脂肽海洋细菌为bacillussp.bs176，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2016年12月，保藏编号：cgmccno.13515。本发明中海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176分离自西太平洋的海山区域，该株细菌具有抑制病原细菌运动能力的活性。通过分析，bacillussp.bs176中的两个脂肽clp1及clp2是其抑制病原细菌运动能力的关键活性分子；同时，clp1及clp2还具有促进多种病原细菌凝集、沉降的活性。利用本发明获得的海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176及其产生的脂肽可用于开发新型海洋病原菌防控制剂。

实施例1：

海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176分离自西太平洋海山区域，该菌能够在2216e培养基中生长，bacillussp.bs176的16srdna参见seqidno.1。

将分离获得海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176接种到2216e液体培养基中，28℃过夜震荡培养。取5ml菌液转接到500ml发酵培养基(蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖5g/l，海水1l，ph7.5)中，28℃震荡培养2天。

发酵结束后，8000转/分离心10分钟收集发酵上清液，上清液用6nhcl溶液调节ph至2.0左右，随后放入4℃层析柜中放置过夜。将过夜的溶液在4℃条件下8000rpm高速离心10min，收集沉淀部分。将得到的沉淀用ph2.0的盐酸溶液清洗3次，再将获得的沉淀用冷冻干燥机冻干。用甲醇对盐酸沉淀的冻干产物进行抽提，将三次抽提的甲醇溶液合并，用旋转蒸发仪浓缩蒸干获得bacillussp.bs176胞外活性物质的粗提物。将芽孢杆菌bacillussp.176产生的粗提物溶于少量甲醇中，经过0.22μm滤膜过滤除去不溶杂质，采用sephadexlh-20凝胶层析柱进行分离纯化。将收集的馏分浓缩蒸干后，溶于少量甲醇中进行活性检测并确定有生物活性的馏分。该馏分进一步用0.22μm有机滤膜过滤并通过高效液相色谱(hplc)进行分离和纯化。所使用的色谱柱为c18制备柱，采用100％色谱级甲醇进行洗脱，流速为2.0ml/min，检测波长为214nm。

通过hplc共分离获得两个具有抑制细菌运动能力活性的单一物质馏分，将这两种活性物质经过一级质谱(esi-ms)和二级质谱(ms/ms)的分析，发现它们的分子量分别为1114.73da和1128.75da，并且它们具有相同的氨基酸组成形式，即由glu-leu-leu-leu-asp-leu-ile组成的环肽结构，并且glu和asp都存在甲氧基的修饰。这两种活性物质进一步经过核磁共振(nmr)的分析发现，它们除了氨基酸链的结构外还存在脂肪酸的结构，说明这个种活性物质均为脂肽分子，并且属于同系物，仅在脂肪酸链的部分相差了一个亚甲基(ch2-)(参见图1)。

所述seqidno.1为：

gggggggtgctatactgcaagtcgagcggacagaagggagcttgctcccggatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggagctaataccggatagttccttgaaccgcatggttcaaggatgaaagacggtttcggctgtcacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgcaagagtaactgcttgcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggctgcgagaccgcaaggtttagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaaggttgtcag

(a)序列特征：

●长度：1445bp

●类型：核苷酸

●链型：单链

(b)分子类型：双链dna

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176

(f)特异性名称：gene

实施例2芽孢杆菌bacillussp.bs176抑制溶藻弧菌运动能力的活性

芽孢杆菌bacillussp.bs176与溶藻弧菌vibrioalginolyticus分别接种于5ml2216e液体培养基中，28℃震荡培养过夜。分别将这两种细菌的菌液用无菌的2216e液体培养基稀释至od600值0.2后，取1μl的溶藻弧菌v.alginolyticus菌液接种于2216e固体培养基的中央，再取1μl的芽孢杆菌bacillussp.bs176接种于上述已接种的2216e固体培养基中并于溶藻弧菌v.alginolyticus的旁边，两种细菌在28℃的条件下进行共培养。培养结束后，发现在接种了芽孢杆菌bacillussp.bs176一侧的培养基上，溶藻弧菌v.alginolyticus菌落的运动受到了明显的抑制，说明bacillussp.bs176能够抑制溶藻弧菌v.alginolyticus的运动能力(图2a，其中a-a，溶藻弧菌；a-b，bacillussp.bs176)。

将芽孢杆菌bacillussp.bs176的两个脂肽分子clp1、clp2以及它们的混合物clps分别溶解于dmso中制备成脂肽溶液。取1μlod600值为0.2的溶藻弧菌v.alginolyticus接种于含有1％琼脂的2216e固体培养基上。28℃培养6小时后，将三种脂肽溶液(20μl)和等体积的dmso分别滴加到溶藻弧菌v.alginolyticus菌落周围的无菌滤纸片上，脂肽溶液的浓度均为10mg/ml。将2216e固体培养基于28℃继续培养4小时后，可以观察到含有脂肽溶液的滤纸片能够显著地抑制溶藻弧菌v.alginolyticus菌落的运动，并且两种脂肽分子clp1和clp2的活性没有明显的差距(图2b,其中b-a，脂肽clp1；b-b，脂肽clp2；b-c，脂肽clps(clp1+clp2)；b-d，dmso)。

实施例3：芽孢杆菌bacillussp.bs176脂肽分子促进溶藻弧菌菌体凝集、沉降的活性

溶藻弧菌v.alginolyticus接种于5ml2216e液体培养基中28℃震荡培养过夜后，按1：100的体积比接种于新鲜的5ml2216e液体培养基，并且于28℃继续培养至od600值0.2-0.3。此时，将浓度为10mg/ml的脂肽溶液clps按1:100(体积比)的稀释度加入到溶藻弧菌v.alginolyticus培养液中于28℃继续培养3小时，同时对照组菌液中加入50μl的dmso。培养结束后，加入脂肽溶液的溶藻弧菌v.alginolyticus出现了菌体凝集的现象，并且凝集的菌体很快便沉降到了试管的底部(图3a)。

利用96孔板的方法对沉降的细菌进行定量分析，将过夜培养的溶藻弧菌v.alginolyticus按1:100的体积比例进行稀释，稀释后的菌液加入到96孔板中(每孔200μl)。随后，把浓度为10mg/ml的脂肽溶液clps按体积梯度(0,0.5,1,2,4and6μl)分别加入到每孔的菌液中，对照孔的菌液中加入6μl的dmso，并将96孔板在28℃继续培养24小时。培养结束后，将96孔板中的菌液移除，此时在加入脂肽clps的孔底部能够明显地观察到沉降的菌体。孔底的菌体用1％结晶紫进行染色后检测其在595nm条件下的od值，利用公式c＝od595实验孔-od595空白孔能够计算出沉淀菌体的量。通过上述实验，发现脂肽clps具有较强的促进菌体凝集沉降的活性，0.5μl10mg/ml的脂肽就能够引起溶藻弧菌v.alginolyticus菌体的凝集(图3)。

实施例4：枯草杆菌bacillussp.bs176脂肽分子活性的广谱性

选取鳗弧菌(a)、铜绿假单胞菌(b)、枯草芽胞杆菌(c)、芽孢杆菌bs176(d)、灿烂弧菌(e)、创伤弧菌(f)、金黄色葡萄球菌(g)和施氏假单胞菌(h)这8种常见的海洋微生物，利用实施例3中的方法对芽孢杆菌bacillussp.bs176脂肽clps的广谱作用进行检测。结果发现，对于能够形成生物膜的微生物(鳗弧菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌和芽孢杆菌bacillussp.bs176)，脂肽clps能够显著降低它们形成生物膜的量；对于不形成生物膜的微生物(灿烂弧菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌和施氏假单胞菌)，脂肽clps促进了这些细菌菌体的凝集、沉降(图4)。这些微生物包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，说明芽孢杆菌bacillussp.bs176的脂肽clps对多种细菌均具有较强的生物活性，也说明脂肽clps具有广泛应用的前景。

sequencelisting

<110>中国科学院海洋研究所

<120>海洋芽孢杆菌及其产生脂肽的应用

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<170>patentinversion3.1

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<212>dna

<213>海洋芽孢杆菌bacillussp.bs176

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