一种靶向抑制绿色荧光蛋白GFP基因表达的siRNA序列的制作方法

本发明涉及基因沉默技术领域，特别涉及一种靶向抑制绿色荧光蛋白gfp基因表达的sirna序列。

背景技术：

绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)来自发光水母(aequoreavictoria),其蛋白大小27kda，由238个氨基酸构成,自身是一个生物发光系统,附带有激发后能发射生物荧光的发光色基,其发光过程不同于其它生物发光组织,是不需荧光素酶参与的。光激发gfp荧光是一个特异性的独立过程,并不需要任何的协同因子、底物或其它来自于水母的基因表达产物。gfp蛋白作为标记物，广泛的应用于目标蛋白的标记物，gfp基因在n或c末端与异源基因接合构成编码融合蛋白的嵌合基因,其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性,又表现出与天然gfp相似的荧光特性(wang&hazelrigg,1994；marshalletal.,1995；stearns,1995)。gfp作为荧光标签蛋白主要应用于活体或细胞离体内追踪某一特定蛋白的合成、运输和定位研究分析。

rna干扰(rnainterference,rnai)是指由内源或外源双链rna(double-strandedrna，dsrna)引发的转录后基因沉默机制，这种基因沉默机制具有高度特异性、高效性、持久性的特点。rnai机制本身是自然界中一种普遍的现象，是一种高度保守的抵御机制。

在进行rnai实验过程中，需要制备sirna，设计高效的sirna序列是rnai实验成败的前提。目前研究主要集中在对哺乳动物细胞，进行高效的sirna序列的设计和实验鉴定；而对于鱼类细胞系sirna的序列专一性要求非常严谨，与靶mrna之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

技术实现要素：

本发明公开一种靶向抑制绿色荧光蛋白gfp基因表达的sirna序列，本发明所设计的针对gfp蛋白的sirna序列在鱼类细胞系(cik)中能够利用rnai机制高效的抑制gfp蛋白的表达。

为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

一种靶向抑制绿色荧光蛋白gfp基因表达的sirna序列,其特征在于：所述的sirna序列为：

有义链：

5’-gauccg-cacaagcuggaguacaacu-uucaagaga-aguuguacuccagcuugug-uuuuuuggaaa-3；

反义链：

3’-gc-guguucgaccucauguuga-aaguucucu-ucaacaugaggucgaacac-aaaaaa-ccuuuucga。

所述sirna的克隆载体为psilencer2.1-u6neo。

述的psilencer2.1-u6neo长度为4521bp。

所述psilencer2.1-u6neo的克隆位点为bamhⅰ/hindⅲ。

所述的sirna用于鱼类细胞系中。

进一步的，所述绿色荧光蛋白gfp的基因序列为：

atgagtaaaggagaagaacttttcactggagtggtcccagttcttgttgaattagatggcgatgttaatgggcaaaaattctctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaattttatttgcactactgggaagctacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttctcaagatacccagatcatatgaaacagcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactatattttacaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaaatggaatacaactataactcacataatgtatacatcatgggagacaaaccaaagaatggcatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattaaagatggaagcgttcaattagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttccaaagatcccaacgaaaagagagatcacatgatccttcttgagtttgtaacagctgctaggattacacatggcatggatgaactatacaaa

本发明的有益效果是：

1、本发明所设计的针对gfp蛋白的sirna序列在鱼类细胞系(cik)中能够利用rnai机制高效的抑制gfp蛋白的表达。

2、该序列实验重复性好，抑制效率非常高。

附图说明

图1：验证sirna基因沉默效果对比图。

图2：验证草鱼呼肠孤病毒感染能够抑制对sirna介导的rnai机制结果对比图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

实施例1

证明sirna的沉默效应：

(1)复苏草鱼cik细胞，盲传3代，至细胞状态达到最好；

(2)将状态好的草鱼cik细胞进行细胞消化，将消化后的cik细胞传至6孔板，待其长至80％满；

(3)向150μlopti-medium加入6μl2000转染试剂，准备2份；

(4)向150μlopti-medium加入pegfp-n1和psilence2.1-u6-nc质粒各7μg；

(5)向150μlopti-medium加入pegfp-n1和psilence2.1-u6-sigfp质粒各7μg；

(6)将(4)中所得试剂与(5)中所得试剂进行混合后获得试剂a，放置半小时；

(7)将(4)中所得试剂与(6)中所得试剂进行混合后获得试剂b，放置半小时；

(8)分别用试剂a与试剂b转染(2)中草鱼cik细胞，27℃细胞培养箱培养5天，观察实验结果。具体结果如图1所示。

最后结果显示共转染pegfp质粒和psilencer2.1-u6neo-sigfp质粒的实验组绿色荧光表达情况显著性的低于pegfp质粒和psilencer2.1-u6neo-nc质粒对照组，表明本实验设计的sirna序列能够在草鱼cik细胞中显著性的抑制gfp蛋白的表达。

实施例2

应用本发明所设计的sirna序列证明草鱼呼肠孤病毒感染能够抑制对sirna介导的rnai机制:

(1)复苏草鱼cik细胞，盲传3代，至细胞状态达到最好；

(2)将状态好的草鱼cik细胞进行细胞消化，将消化后的cik细胞传至6孔板，待其长至80％满；

(3)用gcrv-jx01以moi＝0.1感染草鱼cik细胞；

(4)向150μlopti-medium加入6μl2000转染试剂，准备2份；

(5)向150μlopti-medium加入pegfp-n1和psilence2.1-u6-nc质粒各7μg；

(6)向150μlopti-medium加入pegfp-n1和psilence2.1-u6-sigfp质粒各7μg；

(7)将(4)中所得试剂与(5)中所得试剂进行混合后获得试剂a，放置半小时；

(8)将(4)中所得试剂与(6)中所得试剂进行混合后获得试剂b，放置半小时；

(9)分别用试剂a与试剂b转染(3)中草鱼cik细胞，27℃细胞培养箱培养5天，观察实验结果。具体结果如图2所示。

结果显示，感染gcrv-jx01草鱼cik细胞基因沉默效应大大的减弱了，证明草鱼呼肠孤病毒感染能够抑制对sirna介导的rnai机制。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110>上海海洋大学

<120>一种靶向抑制绿色荧光蛋白gfp基因表达的sirna序列

<130>2017

<141>2017-11-21

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>64

<212>rna

<213>artificialsequence

<400>1

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<210>2

<211>64

<212>rna

<213>artificialsequence

<400>2

gcguguucgaccucauguugaaaguucucuucaacaugaggucgaacacaaaaaaccuuu60

ucga64

<210>3

<211>714

<212>dna

<213>aequoreavictoria

<400>3

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