NCOA1基因SNP位点的应用及其试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及ncoa1基因snp位点的应用及其检测试剂盒。

背景技术：

高繁殖力是绵羊实现高产的基础，也是影响绵羊养殖经济效益最重要的因素之一。现今世界上大概有700多种绵羊品种，绝大多数的绵羊是单胎羊，但有极少数的绵羊品种能够一胎产多羔，并且能够常年发情，这种绵羊我们俗称为多胎羊，如澳洲的booroola羊，我国的小尾寒羊和湖羊，以及新疆的策勒黑羊、多浪羊等。多胎羊在肥羔和羔皮羊的生产中显示出了很大的优越性，在生产效率和经济效益方面多胎羊是单胎羊的2-3倍。因此，研究绵羊的多胎性状，揭示多胎性状的遗传基础，在促进绵羊育种，培育多胎羊品种并利用多胎羊来提高绵羊繁殖力等方面有重要意义。

核受体辅激活蛋白基因(nuclearreceptorco-ctivatorgene，ncoa1)是与类固醇激素受体同源的一类配体依赖性转录因子超家族中的一员,在大脑、子宫、前列腺及胸腺等组织中均有表达。ncao1与结合在dna上的雌激素受体相互作用并加强其转录活性，受到影响的雌激素受体、雄激素受体等受体在动物的生长发育和繁殖等生理过程起到重要作用。ncoa1蛋白能够增强雌激素受体的活性，反过来也刺激特定的雌激素反应基因的转录并调节随后的生理反应。razeto等还提出了ncoa1基因是生殖激素“开关”的观点，认为生殖激素长时间打开是导致哺乳动物繁殖性能增加的原因。然而，关于ncoa1基因对调控绵羊的繁殖性能是否有所作用，尚未见有关文献报道

因此，研究绵羊产羔数相关基因，并对相关位点进行检测对于预测绵羊产羔数具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明目的在于提供ncoa1基因snp位点的应用及其检测试剂盒，本发明提供的试剂盒适用于绵羊产羔数的分子检测，准确性良好。

本发明提供了ncoa1基因snp位点在制备预测绵羊产羔数的产品中的应用。

本发明提供的ncoa1基因snp位点为32015148g>a、32033237a>g，对预测绵羊产羔数具有良好的特异性。

本发明研究发现，绵羊的产羔数与基因类型有关，特别是ncoa1基因32015148g>a、32033237a>g处snp位点的基因型与绵羊产羔数关系密切。ncoa1基因32015148g>a处snp位点的基因型为gg，较aa基因型、ag基因型产羊羔数高；ncoa1基因32033237a>g处的snp位点的基因型为aa，较ga或gg基因型产羊羔数高。

本发明还提供了一种预测绵羊产羔数的方法，根据ncoa1基因snp位点的基因型预测绵羊的产羔数。

ncoa1基因32015148g>a处snp位点的基因型为gg，较aa基因型、ag基因型产羊羔数高；

ncoa1基因32033237a>g处snp位点的基因型为aa，较ga或gg基因型产羊羔数高。

对ncoa1基因snp位点的基因型检测的方法可采用现有技术中的多种snp检测技术，包括但不限于微阵列芯片法、taqman法、质谱法、直接测序法、微测序、高分辨率溶解曲线法或联合应用以上方法。

在本发明提供的一些实施例中，对ncoa1基因snp位点的基因型检测采用直接测序法。

作为优选，ncoa1基因32015148g>a处snp位点的基因型的检测方法包括：

步骤1：以待测样品的基因组dna为模板，以seqidno:1所示核苷酸序列的上游引物和seqidno:2所示核苷酸序列的下游引物进行pcr扩增，获得扩增产物；

步骤2：所述扩增产物经测序判定ncoa1基因32015148g>a处snp位点的基因型。

作为优选，ncoa1基因32033237a>g处snp位点的基因型的检测方法包括：

步骤1：以待测样品的基因组dna为模板，以seqidno:3所示核苷酸序列的上游引物和seqidno:4所示核苷酸序列的下游引物进行pcr扩增，获得扩增产物；

步骤2：所述扩增产物经测序判定ncoa1基因32033237a>g处snp位点的基因型。

作为优选，上述所述扩增体系中，每个反应体系体积为20μl，具体包括：2×pcrmastermix10μl，pcrprimermix1μl(10μm，上游引物和下游引物各0.5μl)，待测dna样品1μl，灭菌双蒸水补至20μl。

作为优选，待测样品的基因组dna溶液的浓度为20-60ng/μl，更优选为50ng/μl。

作为优选，所述扩增的程序为：

本发明提供的方法能够准确检测ncoa1基因32015148g>a、32033237a>g处snp位点的基因型，所用引物具有良好的特异性。

本发明还提供了一种预测绵羊产羔数的试剂盒包括用于扩增ncoa1基因32015148g>a处snp位点的seqidno:1～2所示的引物对、扩增ncoa1基因32033237a>g处snp位点的seqidno:3～4所示的引物对。

作为优选，本发明提供的试剂盒还包括pcrmastermix和灭菌双蒸水。

本发明研究发现，noca1基因的第十二外显子和第十七外显子区域的两个snp位点：32015148g>a、32033237a>g，与多浪羊产羔数具有相关性(p<0.05)。为预测和分子选育高产羔数的绵羊品种提供了分子水平的技术支撑，应用本发明将大幅度提高绵羊的产羔数，产生更好的养殖经济效益，具有良好的应用前景。

附图说明

图1示引物对seqidno:1～2的pcr扩增结果；

图2示引物对seqidno:3～4的pcr扩增结果；

图3示ncoa1基因snp位点32015148g>a的测序结果；

图4示ncoa1基因snp位点32033237a>g的测序结果。

具体实施方式

本发明提供了ncoa1基因snp位点的应用及其检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的材料、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本发明所用的试剂均为市售产品。其中，pcrmastermix购于北京天根生物技术有限公司，dnamarker等购自bbi公司。

引物对seqidno:1～2、seqidno:3～4由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(一)本发明采用直接测序法对ncoa1基因处snp位点32015148g>a的基因型进行检测。

正向引物为seqidno:1：5’—ttccagtgttaggtcatgcta—3’

反向引物为seqidno:2：5’—cactcccaataaacaaaaggt—3’

采用seqidno.1～2所示的引物序列扩增目的基因片段。pcr反应体系为：2×pcrmastermix10μl，pcrprimermix1μl(10μm，上游引物和下游引物各0.5μl)，待测dna样品1μl((浓度为50ng/μl)，灭菌双蒸水补至20μl。pcr扩增程序：94℃5min；94℃30s，62～55℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃7min；4℃保持。

2、2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，在凝胶成像仪上成像观察，部分样品的检测结果如图1所示，其中，目标片段大小为461bp。

3、pcr扩增产物由上海生工完成测序，采用mega6.0和chromas对测序所获得的序列和峰图进行比对，比对结果如图3所示，同一位点(图中箭头所示)aa、gg为纯合子为纯合子，ag为杂合子(a-g套峰)，说明该位点在群体中发生突变，具有多态性。

(二)本发明采用直接测序法对ncoa1基因32015148g>a处snp位点的基因型进行检测。

正向引物为seqidno:3：5’—cagcgccagcgggagttata—3’

反向引物为seqidno:4：5’—tggggttggttgaatccacagat—3’

采用seqidno.3～4所示的引物序列扩增目的基因片段。pcr反应体系为：2×pcrmastermix10μl，pcrprimermix1μl(10μm，上游引物和下游引物各0.5μl)，待测dna样品1μl(浓度为50ng/μl)，灭菌双蒸水补至20μl。pcr扩增程序：94℃5min；94℃30s，62～55℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃7min；4℃保持。

2、2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，在凝胶成像仪上成像观察，结果如图2所示，其中，目标片段大小为467bp。

3、pcr扩增产物由上海生工完成测序，采用mega6.0和chromas对测序所获得的序列和峰图进行比对，比对结果如图4所示，同一位点(图中箭头所示)gg、aa为纯合子，ga为杂合子(g-a套峰)，说明该位点在群体中发生突变，具有多态性。

实施例2snp位点的基因频率、基因型频率分布情况以及相关性分析

采用实施例1的方法，对168只新疆多浪羊母羊的血液样品进行检测，其中，产单羔母羊112只，产双羔母羊55只，产三羔1只，获得ncoa1基因多态性位点的基因型，基因型频率及等位基因频率见表1。经卡方适合性检验，这两个位点均处于hardy-weinberg平衡状态，说明这两个snp位点的基因型频率没有受到选择、突变或迁移等因素的影响。

表1基因型频率和基因型频率

对多浪羊群体在ncoa1基因的2个snp位点的纯合度、杂合度、有效等位基因数以及多态信息含量进行统计分析，结果见表2。

表2多浪羊群体多态位点多态信息量、纯合度、杂合度和等位基因数分析

注:pic>0.5为高度多态,0.25<pic<0.5为中度多态,pic<0.25为低度多态

真实记录实验群体168只多浪羊的产羔数，利用spss13.0统计分析软件，采用最小二乘方差分析ncoa1基因snp位点与产羔数的相关性，结果见表3。

表3ncoa1和inhba基因snp位点与多浪羊产羔数的相关性

注：不同基因型之间比较，有任一字母不同者为差异显著，小写字母表示p<0.05。

结果显示，noca1基因snp位点32015148g>a、32033237a>g的基因型与多浪羊产羔数相关性显著(p<0.05)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>新疆畜牧科学院生物技术研究所（新疆畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心）

<120>ncoa1基因snp位点的应用及其试剂盒

<130>mp1721672

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttccagtgttaggtcatgcta21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cactcccaataaacaaaaggt21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cagcgccagcgggagttata20

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tggggttggttgaatccacagat23