一种稻瘟病抗性基因座Pik功能基因分子标记及其应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因座pik功能基因分子标记及其应用。

背景技术：

由稻瘟病菌(magnapotheoryzae)引起的稻瘟病害是世界水稻产区最重要的病害（qu1985，maetal.2015）。生产实践表明，利用抗病基因选育抗病品种是防治稻瘟病最为安全有效的措施。但由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，单一抗性品种的抗性往往会在种植后的3〜5年时间里逐渐丧失；因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是抵御稻瘟病菌的有效手段。近年来，随着分子遗传学的发展，至少有100多个位点和25个抗性基因得以被精细定位或克隆。另外，更加准确有效的分子标记的发展及应用，也逐渐替代了传统的接种鉴定方法。在已克隆的抗性基因中，一些抗病基因位于同一位点，这些复等位基因之间、功能型序列与非功能型之间序列高度同源，一般的连锁标记仍然难以准确甄别各种材料的功能抗病基因。因此，直接分析功能等位基因的保守序列并开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，还会大大加快了育种步伐。

近年来，有关于pik等位位点的抗性基因的研究有了很大进展，目前该抗性位点上至今已至少发现有6个不同的抗性基因，已有研究表明，这些抗性基因都具有广谱高抗的特点，在抗病育种中具有很高的应用价值。然而，目前育种中还缺乏简单方便的标记，为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因座pik应用到水稻抗性育种工作中，有必要开发真实反映目标基因、方便易用的功能基因分子标记。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种稻瘟病抗性基因座pik功能基因分子标记pik-indel。

本发明的另一目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因座pik功能基因分子标记pik-indel的检测方法。

本发明的再一目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因座pik功能基因分子标记pik-indel的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种稻瘟病抗性基因座pik功能基因分子标记pik-indel，是通过引物对seqidno.1和seqidno.2从水稻基因组dna中扩增出与稻瘟病抗性基因座pik功能基因呈特异性带型的分子标记；

fl:seqidno.1（5’-3’）:aactgagtaggagggtggacat；

rl:seqidno.2（5’-3’）：ttttgagacaaggctgactata；

所述的水稻品种为irblk-ka(pi-k)、irblkp-k60(pi-k^p)、irblkh-k3(pi-k^h)、irbl1-cl(pi-1)、irblkm-ts(pi-k^m)、irblks-s(pi-k^s)；

所述的稻瘟病抗性基因座pik5’-utr端的序列片段i，

i:aactgagtaggagggtggacatatgcaacaaaataacttatgggatggaatgtcaaacttcaaataacttatggggtggttttttttctatattatttaatatagtcagccttgtctcaaaa。

所述的稻瘟病抗性基因座pik功能基因分子标记pik-indel的检测方法，通过比对6个水稻稻瘟病抗性基因座pik两端的等位基因序列，包含以下步骤:

(1)从ncbi公共数据库中下载得到pik基因座功能基因irblk-ka(pi-k)、irblkp-k60(pi-k^p)、irblkh-k3(pi-k^h)、irbl1-cl(pi-1)、irblkm-ts(pi-k^m)、irblks-s(pi-k^s)及其测序品种日本晴(nipponbare)相对应区域的基因组序列，向基因两端扩增，筛查pik特异的、能区别于该位点非功能等位基因的插入/缺失(insertion-deletion,indel)位点；

(2)利用步骤(1)获得的indel信息，根据indel标记的设计原理，在所述indel位点处上下游100-200bp处设计基因特异性引物，引物对碱基序列如下:

fl:5-aactgagtaggagggtggacat-3；

rl:5-ttttgagacaaggctgactata-3；

(3)以携带有稻瘟病抗性基因pi1、pi-k、pi-k^p、pi-k^h、pi-k^m和pi-k^s的稻瘟病抗性品种的总dna为模板，进行pcr扩增，所获得的pcr产物即为稻瘟病抗性基因座pik基因特异性分子标记pik-indel；

所述的稻瘟病抗性基因座pik功能基因分子标记pik-indel在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，特别适合于在鉴别pik基因座功能基因的应用；优选包含如下步骤:

(1)扩增:利用引物fl和rl对待检测的水稻品种的基因组进行pcr；

(2)检测:利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，若检测到分子量大小为122bp的核苷酸片段，则携带有稻瘟病抗性基因座pik的功能基因；若检测到分子量大小为133bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有该位点稻瘟病非功能基因。

本发明的原理:稻瘟病抗性基因座pik包含至少有6个抗病基因，这些等位基因间序列高度同源，说明它们可能有共同的亲缘关系。因此，这必然会引起这些抗性基因两端序列的连锁不平衡，即与这些基因紧密相连的两端序列具有保守的共分离关系。indel（insert-deletion）标记基于pcr扩增技术，本质上属于长度多态性标记(hytenetal,2010)。indel标记稳定性好、多态性高、分型系统简单(janderetal,2002)；与分型系统复杂的snp标记相比，indel检测更加简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，在电泳技术平台上即可进行。目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。本发明通过6个功能基因与日本晴序列比对的方法寻找pik功能基因序列上出现的indel，由于这个indel在pik功能基因与非功能基因有11bp的差异，因此很容易将pik功能基因从中区分出来。本发明据此设计引物对f1/r1，通过常规pcr扩增，在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，以不同大小的片断得以呈现。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:

(1)本发明提供的分子标记特异性高:目前已在pik区域克隆到6个功能基因，这些基因在功能与非功能基因间存在多个重复与高度序列同源(huaetal.2012)。因此，很难找到适合的区间能将功能基因与非功能基因区分的标记。本发明提供的分子标记是本发明人经过对6个功能基因与非功能基因的两端序列不断的进行搜查并通过实验验证得到的，能明显地将基因座pik功能基因与存在于该基因组区域内非功能基因进行区分。

(2)本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量:目前大多是利用电泳平台进行分型，该分型平台快捷经济，不需要复杂的实验设备，可操作性强。电泳分型平台有琼脂糖凝胶电泳、变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳。本发明提供的分子标记只需pcr结合琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，特别适用于生产实践中。

(3)本发明是第一个针对基因座pik功能基因两端保守indel开发的分子标记。本发明能通过电泳检测的方法成功地将基因座pik功能基因与非功能基因区分开的共显性标记，到目前为止，还没有有关这类标记的报道。本发明所提供的基因座pik功能基因特异性分子标记pik-indel是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性及准确性优于显性标记。本发明可应用于基因座pik功能基因的种质资源筛选、转基因鉴定和基因聚合以及基于mas技术的水稻抗性育种工作中。该标记与基因座pik功能基因连锁不平衡，因此对pik功能基因的筛选能力理论值可达100%，其综合性能优于已报道的与单个基因座pik功能基因连锁的分子标记和功能标记。

(4)本发明提供的分子标记能简便地应用于遗传背景不同的群体中。现有的与基因座pik功能基因连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体两个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标记在其它群体中的适用性有限。panetal(2012)等开发的鉴定标记，由于鉴定过程比较繁琐，不适应于大规模的种质资源鉴定及mas育种中。本发明适用于任何遗传背景下的转基因育种，基因聚合以及基于mas技术的抗性育种，无需重复进行亲本多态性的筛选，大大提高了育种效率。

因此，本发明所提供的稻瘟病抗性基因座pik功能基因特异性分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高该基因在种质资源筛选、分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

附图说明

图1是基因座pik功能基因特异性分子标记pik-indel在pik基因簇区域不同稻瘟病抗性基因及日本晴、co39的验证结果图，其中：泳道1为dnaladder，泳道2〜10的dna模板依次为抗性品种irbl1-cl(pi1)、抗性品种irblk-ka(pik)、抗性品种irblkp-k60(pik-p)、抗性品种irblkm-ts(pik-m)、抗性品种irblkh-k3(pik-h)、抗性品种irblks-s(pik-s)、感病品种日本晴(npb)、感病品种co39。

图2是基因座pik功能基因特异性分子标记pik-indel在其它水稻品种中的验证结果图，其中：泳道1为dnaladder，泳道2-21的dna模板依次为抗性基因供体品种irblk-ka(pik)、618b、宜香1b、花香b、ii-32b、629b、五丰b、安丰b、珍汕97b、金23b、d702b、福伊b、se21s、闽丰b、朝阳一号b、黎明b、金南特43b、优1b、岳4b、d62b和广抗13b。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1:稻瘟病抗性基因座pik功能基因分子标记及其引物设计与检测

(i)基因座pik插入/缺失(insertion-deletion，indel)位点的分析:

从公共数据库中下载得到pi1，pik-m，pik，pik-p，pik-s和pik-h水稻供体品种的部分基因组序列,测序品种日本晴(nipponbare)相对应区域的基因组序列，针对基因座pik功能基因的两端序列测序比对，筛查基因座pik功能基因特异的、能区别于该位点非功能基因的特异性插入/缺失(indel)差异位点。具有基因特异性indel的水稻稻瘟病抗性基因性品种irbl1-cl(pi1)与抗性品种irblk-ka(pik)、抗性品种irblkp-k60(pik-p)、抗性品种irblkm-ts(pik-m)、抗性品种irblkh-k3(pik-h)和抗性品种irblks-s(pik-s)与日本晴多序列比对结果下表所示:

其中，加粗的核苷酸即为鉴定到的基因座pik功能基因特异性插入序列；

(2)设计引物:

根据indel标记的设计原理，在所述indel位点处上下游100-200bp处设计引物，引物对碱基序列如下所示:

fl:5′-aactgagtaggagggtggacat-3′；

rl:5′-ttttgagacaaggctgactata-3′。

(3)选择水稻代表品种:选择携带有基因座pik功能基因和非功能基因的代表品种如下:

水稻品种irbl1-cl，为pi1供体品种(fukutaetal.2004)；

水稻品种irblk-ka，为pik供体品种(fukutaetal.2004)；

水稻品种irblkp-k60，为pik-p供体品种(fukutaetal.2004)；

水稻品种irblkm-ts，为pik-m供体品种(fukutaetal.2004)；

水稻品种irblkh-k3，为pik-h供体品种(fukutaetal.2004)；

水稻品种irblks-s，为pik-s供体品种(fukutaetal.2004)；

感病对照品种:日本晴，日本晴是日本选育的一个品种，在国家水稻数据中心可以获得相关信息；

感病对照品种:co39。

(4)pcr扩增，获得含有基因座pik功能基因特异性indel的片段

利用上述引物对fl和r1，以上述水稻品种的总dna为模板，进行常规pcr扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到的结果如图1所示。

扩增反应体系如下:

2xreactionmix:12.5μl；

引物fl(10μμ):1μl；

引物rl(10μμ):1μl；

goldendnapolymerase:0.2μl；

dna模板(20-50ng/μl):1μl；

ddh2o:补足至25μl。

pcr温度循环条件如下:94℃5分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。

pcr反应结束后，取适量样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90v，1小时。

其中，图1的泳道i-vi为基因座pik功能基因供体品种基因组为模板pcr得到的片段，与稻瘟病抗性基因座pik功能基因呈特异性带型，即泳道i-vi为基因座pik功能特异性分子标记pik-indel。图1的结果显示，pik-indel能将基因座pik的功能基因与非功能基因区分开来。也就是说，凡是携带有基因座pik的功能基因的水稻品种，其pcr扩增产物的电泳检测条带以122bp呈现，在基因座pik上非抗性基因以电泳检测条带133bp呈现。

实施例2:pik-indel在鉴别pik基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的应用。

根据多态性的pcr产物条带，可以把基因座pik的功能基因与非抗性基因区分开来。如图1所示，122bp表示含有基因座pik的功能基因，133bp则表示含有该位点的非抗性基因。可见试验结果与设计分析的相吻合，说明pik-indel可在基因座pik的功能基因与pik基因族等位基因等方面得到应用。

实施例3:基因座pik功能基因特异性分子标记在其它水稻品种中的检测应用

选择21个代表性水稻品种，依次为:irblk-ka(pik)、618b、宜香1b、花香b、ii-32b、629b、五丰b、安丰b、珍汕97b、金23b、d702b、福伊b、se21s、闽丰b、朝阳一号b、黎明b、金南特43b、优1b、岳4b、d62b和广抗13b。

分别提取其基因组dna，并以此为模板，按照实施例1的方法，进行pcr扩增及电泳检测。根据条带的大小，可以把基因座pik功能基因与其他非抗性基因区分开来。如图2所示，在抗谱表型为pik型的个体(携带有稻瘟病抗性基因pik的抗病品种irblk-ka，泳道1的样品)中能检测到pik-indel功能基因特异性分子标记的存在，而其他抗谱表型的个体则是非抗性基因的带型。可见，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因座pik功能基因分子标记可在鉴别基因座pik功能基因与其他非抗性基因方面得到应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院生物技术研究所

<120>一种稻瘟病抗性基因座pik功能基因分子标记及其应用

<130>5

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aactgagtaggagggtggacat22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ttttgagacaaggctgactata22

<210>3

<211>122

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aactgagtaggagggtggacatatgcaacaaaataacttatgggatggaatgtcaaactt60

caaataacttatggggtggttttttttctatattatttaatatagtcagccttgtctcaa120

aa122

<210>4

<211>65

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

caaataacttatggggtggttttttttttaatttttttctatattatttaatatagtcag60

ccttg65

<210>5

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

caaataacttatggggtggttttttttctatattatttaatatagtcagccttg54