本发明属于植物保护与生物防治领域，涉及一种枯草芽孢杆菌ggt蛋白降解产物的新功能及其抗菌肽鉴定。
背景技术
马铃薯作为我国的主要粮食作物被广泛种植，仅次于水稻、小麦和玉米，近年来逐渐成为很多省份的重要经济来源，而优质的马铃薯种薯则是这一经济来源的基础。马铃薯疮痂病主要在土壤中进行传播，在马铃薯种植过程中极易感染，近年来由疮痂链霉菌引起的马铃薯疮痂病日益严重，直接影响马铃薯的品质，使马铃薯产业产生了巨大的经济损失。
病原微生物造成的植物病害严重地阻碍了我国农业的发展。化学农药的大量使用不仅会对环境造成严重的污染，还会使人类的健康受到威胁。近年来，越来越多的生防菌株被研究并初步应用到植物病害的生物防治中，取得了较好的防效，发展前景广阔。
大部分生防菌株依靠自身产生的活性物质实现对病原菌的抑制，其中抗菌肽(antimicrobialpeptide，amp)就是一类比较有代表性的活性物质，也是生物体先天免疫系统的重要组成部分。多年以来，人们从不同种类的生物体中发现了大量的未知抗菌肽，它们是一类带正电荷的两亲性小分子抗菌肽。这种小分子抗菌肽对细菌和病毒均具有抵抗作用，从而使病原不能够侵入细胞内部。此外它们还具有清除体内突变细胞的功能。
芽孢杆菌是一种理想的生防微生物，对高温、紫外线和酸碱环境均具有一定的耐受性，能够有效抑制多种病原菌，对病害起到良好的防治效果。目前，已出现多种芽孢杆菌与生物防治相关的报道，包括蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、多粘芽孢杆菌(bacilluspolymyxa)和解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)等。此外，芽孢杆菌产生的抗菌物质如多肽、多糖、次生代谢物、抗菌蛋白等，是其拮抗病原菌的主要物质基础。但由于芽孢杆菌的种类众多，其生防效果及产生的抗菌物质均存在较大差异，因此来自于芽孢杆菌的抗菌物质仍有待进一步开发。
γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase，ggt)分布非常广泛，从细菌到哺乳动物体内都有存在。该酶能催化3种类型的反应：转肽反应、自转肽反应和γ-谷氨酰基的水解反应。ggt在临床检测中可作为生物标志物，已经用作肝脏和其他疾病的常规检测指标。该酶在生物催化合成中也有相当重要的应用，利用此酶可以合成多种含γ-谷氨酰基的化合物。ggt蛋白具有信号肽，为细胞外分泌表达，在翻译后修饰过程中会自发进行剪切成为大小两个亚基，分子量分别约为40kda和20kda。在芽孢杆菌的培养过程中，在上清液中能够长时间检测到该酶及其降解片段的大量存在，但并没有关于该酶及其降解片段与抑菌活性相关的报道。
技术实现要素：
本发明的第一目的是鉴定枯草芽孢杆菌ggt蛋白降解产物的新功能，其降解产物具有对疮痂链霉菌具有抗菌活性。
本发明的第二目的是提供一种枯草芽孢杆菌ggt蛋白的抗菌肽。
本发明的第三目的是提供另一种枯草芽孢杆菌ggt蛋白的抗菌肽。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种枯草芽孢杆菌ggt蛋白的降解产物具有对疮痂链霉菌的抑菌活性。
二、一种枯草芽孢杆菌ggt蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如seqidno:1所示。
上述的枯草芽孢杆菌ggt蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
三、一种枯草芽孢杆菌ggt蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如seqidno:2所示。
上述的枯草芽孢杆菌ggt蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
首先对枯草芽孢杆菌的培养液上清进行硫酸铵沉淀和离子交换层析，对于分离到的蛋白质组分，检测其对疮痂链霉菌的抗菌活性。具有抗菌活性的蛋白质组分进行sds-page电泳，切取蛋白质条带进行质谱测序。测序结果经数据库比对分析确认蛋白质组分为γ-谷氨酰转肽酶(ggt)的组成部分，从而推测枯草芽孢杆菌ggt蛋白的降解产物具有抗菌活性。
随后通过抗菌肽在线预测的方法分析枯草芽孢杆菌的ggt蛋白质序列，预测得到多种抗菌肽，选取3种抗菌肽进行多肽合成和活性测试，最终确认2条对疮痂链霉菌具有抑菌活性的抗菌肽seqidno:1(iqkdlaktfklirsngtdaf)和seqidno:2(atiissvlqtilyhieygmelkaave)。
采用上述技术方案的积极效果：本发明发现了已知的枯草芽孢杆菌ggt蛋白在降解后具有抗疮痂链霉菌的活性，并进一步从枯草芽孢杆菌ggt蛋白的降解产物中鉴定出了抗菌肽序列，为马铃薯疮痂病的生物防治工作提供了新的思路。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌抑菌物质的阴离子交换层析图谱，p1、p2、p3：分别为三个洗脱峰；
图2为枯草芽孢杆菌不同分离组分对疮痂链霉菌的活性测试，ck：对照，1：培养液上清，2：硫酸铵沉淀组分，3：离子交换层析洗脱峰p1，4：离子交换层析洗脱峰p2，5：离子交换层析洗脱峰p3；
图3为离子交换洗脱峰p2的sds-page电泳图，m：蛋白质分子量marker，1：离子交换洗脱峰p2，b3：离子交换洗脱峰p2中的目的蛋白质条带；
图4为蛋白质条带b3进行maldi-tof质谱测序分析得到的质谱图；
图5为质谱测序结果进行mascot比对得到的最优结果：γ-谷氨酰转肽酶，genbank登录号为kiu12867.1；
图6为在线预测获得的3种ggt蛋白的抗菌肽在三维结构中的定位，ae26、lt30、if20分别为预测的抗菌肽，都为α-螺旋；
图7为3种预测抗菌肽对疮痂链霉菌的抗菌活性测试结果；
图8为枯草芽孢杆菌ggt蛋白两个亚基的重组表达蛋白在不同时间内的降解情况，m：蛋白质分子量marker，1-9：分离纯化1-9小时后的蛋白质样品，ggt-a：ggt蛋白大亚基(36-402氨基酸)，ggt-b：ggt蛋白小亚基(403-587氨基酸)。
图9为枯草芽孢杆菌ggt蛋白降解产物的抗菌活性测试结果，1：降解0小时的ggt蛋白样品，2：降解9小时后的ggt蛋白样品。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。
本发明中生物材料的来源：
1、所用的枯草芽孢杆菌bu412于2016年3月23日中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为cctccno：m2016142；
2、疮痂链霉菌，普城沙雷氏菌bu09的分离鉴定及其对疮痂链霉菌的防治效果，安徽农业科学，2017年第45卷11期，123-124页，作者：张竹君，刘权，该菌种一直保存在黑龙江八一农垦大学，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；
3、抗菌肽为委托上海楚肽生物科技有限公司合成。
实施例1
枯草芽孢杆菌ggt蛋白的分离纯化与质谱鉴定。
将枯草芽孢杆菌bu412接种至yme液体培养基(麦芽糖10g/l、酵母浸粉4g/l、葡萄糖4g/l、ph7.5)进行过夜培养，12000g离心收集上清，使用80％的硫酸铵沉淀得到蛋白组分，使用20mmtris-hcl(ph7.5)缓冲液溶解沉淀，经过0.22μm的滤膜过滤，使用akta蛋白纯化仪进行阴离子交换层析，使用的纯化柱为ge公司的qhp阴离子交换柱(柱体积为5ml)。使用20mm的tris-hcl(ph7.5)缓冲液上样并平衡，以0.5mnacl，20mmtris-hcl(ph7.5)缓冲液进行0-100％的线性梯度洗脱，根据吸收峰收集蛋白组分p1-p3(图1)，使用牛津杯法测定各分离组分对疮痂链霉菌的抗菌活性(图2)。对于具有抗菌活性的蛋白组分p2进行sds-page电泳检测(图3)。
切取图3中的蛋白条带，将胶条送交上海中科新生命生物科技有限公司进行maldi-tof质谱测序(图4)，经mascot软件搜索ncbi数据库，发现该蛋白条带属于γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyltransferase，ggt，genbank登录号为kiu12867.1)(图5)，其氨基酸序列如seqidno:4所示。
实施例2
枯草芽孢杆菌ggt蛋白中抗菌肽的预测。
将ggt蛋白(genbank登录号为kiu12867.1)的氨基酸序列在campr3数据库上进行抗菌肽区域的在线预测，发现ggt的多条多肽具有构成抗菌肽的可能，结合这些多肽在ggt蛋白三维结构中的二级结构和定位(图6)，从中选择3条多肽(表1)在apd数据库进行在线分析。结果表明，3条多肽均能形成具有疏水面的α螺旋，可能具有抗菌肽的活性。根据3条多肽链氨基酸的个数，分别命名为lt30、ae26和if20。此外，从pdb数据库中查询ggt蛋白的三维结构并使用pymol软件对这3条肽链进行了空间定位(图6)。
表1预测的ggt蛋白抗菌肽的序列
实施例3
预测抗菌肽的合成与活性检测。
利用固相多肽合成技术合成3条枯草芽孢杆菌的ggt蛋白的候选抗菌肽，合成的多肽n端乙酰化，c端酰胺化，纯度达到95％以上。多肽以50mm终浓度溶解于20mm的tris-hcl(ph8.0)缓冲液中。使用牛津杯法测定这3条多肽对疮痂链霉菌的抗菌活性。结果显示，多肽lt30对疮痂链霉菌不具有抑制效果，ae26和if20对疮痂链霉菌具有抑制作用，其中if20的效果要优于ae26(图7)。
实施例4
枯草芽孢杆菌ggt蛋白的自然降解。
将γ-谷氨酰转肽酶中两个亚基(ggt-a、ggt-b)的编码基因交由华大基因有限公司进行全基因合成，并亚克隆到pet28a载体中，转化bl21(de3)感受态细胞，挑取阳性克隆获得ggt-a和ggt-b两个亚基的表达菌。两种表达菌分别经过培养和iptg诱导，收集菌体并合并后，进行超声波破碎，使用ni-nta亲和层析柱进行纯化和脱盐后，加入等体积的枯草芽孢杆菌培养液上清(0.22μm的滤膜过滤除菌)进行自然降解试验，每小时取样进行sds-page电泳检测蛋白质的降解情况，共取样9次。结果显示(图8)，ggt-a大亚基降解较快，1-5小时期间大部分降解，9小时基本完全降解；ggt-b小亚基降解相对较慢，5小时后开始明显降解，9小时大部分降解。
实施例5
枯草芽孢杆菌ggt蛋白降解产物的抗菌活性检测
取实施例4中ggt蛋白纯化后自然降解9小时的样品，通过抑菌圈法对疮痂链霉菌进行抗菌活性测试，以降解0小时的样品作为对照。结果显示，未降解的ggt蛋白样品不具有对疮痂链霉菌的抗菌活性，而降解9小时后的ggt蛋白样品具有对疮痂链霉菌的抗菌活性(图9)。
本发明发现了已知的枯草芽孢杆菌ggt蛋白在降解后具有抗疮痂链霉菌的活性，并进一步从枯草芽孢杆菌ggt蛋白的降解产物中鉴定出了抗菌肽序列，为马铃薯疮痂病的生物防治工作提供了新的思路。
序列表
<110>黑龙江八一农垦大学
<120>枯草芽孢杆菌ggt蛋白降解产物的新功能及其抗菌肽鉴定
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