一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，特别涉及一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用。
背景技术：
：dna片段之间的连接是通过dna连接酶的催化实现的。dna连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的dna片段间相邻碱基通过3’羟基末端，5’磷酸末端形成磷酸二酯键连接起来，该反应为需能反应，通常需要加入atp或nadh，dna连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因工程实验中，最常用连接酶是的来源于t4噬菌体的t4dna连接酶。其对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式使目的片段之间能够匹配。很多公司在合成引物时，若客户无特殊要求，引物的5’端都是去磷酸化的，一般只有客户要求的时候，才会给合成磷酸化的5’末端，并且需要另外收取较高的费用，这给本就价格不菲的序列合成工作又增加了一些经济负担。技术实现要素：基于现有技术的缺陷，本发明提供了一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用，使用本方法构建长片段目的基因所需的成本较低，具有更好的经济效益。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法，包括以下步骤：s1：将目的基因序列根据实际需要分段，并分别在每段的两端加入酶切位点序列，然后合成相应目标产物序列片段；s2：利用t4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端将目标产物磷酸化；s3：将磷酸化的目标产物退火，得到目的片段；s4：将载体质粒酶切，所形成的粘性末端与步骤s1中所加入的酶切位点序列对应，并回收酶切产物，得到载体片段；s5：将目的片段与载体片段连接，得到连接产物。进一步地，在步骤s5后面依次增加s6、s7，其中，s6：将连接产物转化至宿主菌中，并进行抗性培养基培养；s7：对s6中抗性培养阳性的菌株提取质粒并测序，通过序列比对判断是否成功构建质粒。进一步地，步骤s1中，目标产物合成后，用ph为8.5，浓度为10mmol/l的tris-hcl配制浓度为0.25nmol/l的目标产物。一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法在构建长片段目的基因中的应用。一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法在构建长片段目的基因的试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果是：传统的构建长片段目的基因的方法一般分为两种，例如需要插入的目的基因片段是100bp，传统方法一是将整个100bp目的基因让生物公司合成，合成后然后插入相应的载体中，方法一合成该目的基因的成本需要1000元/od，并且在合成的碱基大于60bp后碱基的突变率会增加，导致构建该质粒的准确性降低了，若是按照该方法构建的质粒，后期出现目的基因的突变需要额外的费用去进行修改。传统方法二是将整个100bp目的基因片段分成2段，因此需要合成的费用为200元，但是需要在2对引物的5’末端加入磷酸基团修饰需要250元/端，因此按照该方法需要的成本为700元/od。而按照本发明的技术方案，将目的基因分两段合成，需要成本为120元/od，经济负担明显减少。而且本实验的方案简单，容易操作，所涉及到的酶容易够买，并且可以多次使用。并且用该方法使得碱基突变概率得到有效控制。附图说明图1是本发明原理流程图；图2是目的基因序列酶切插入位点示意图；图3是mix3-1和mix4-1目的片段酶切插入位点示意图。具体实施方式下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明披露了一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用，具体如下所示，原理流程如图1所示。实施例s1：将目的基因序列根据实际需要分段，并分别在每段的两端加入酶切位点序列，然后合成相应目标产物序列片段。本实施例中将待构建的长片段磷酸化目的基因序列分为两段，具体为:5’tcgaggtcgacggtatcgataagctcgcttcacgagattccagcaggtcgagggacctaattaagggttccaagcttaagc3’，见seqidno：1。3’ccagctgccatagctattcgagcgaagtgctctaaggtcgtccagctccctggattaattcccaaggttcgaattcgccgg5’，见seqidno：2。且在每段的两端分别加入酶切位点序列，如图2所示。针对两端序列分别设计引物，以引物的形式合成，之后送至第三方生工生物公司合成。引物序列如下：1f，5'tcgaggtcgacggtatcgataagctcgcttcacgagattcc3'，见seqidno：3；2r，5'cctgctggaatctcgtgaagcgagcttatcgataccgtcgacc3'，seqidno：4；3f，5'agcaggtcgagggacctaattaagggttccaagcttaagc3'，seqidno：5；4r，5'ggccgcttaagcttggaacccttaattaggtccctcga3'，seqidno：6。将合成的引物干粉4℃离心机12000r离心5分钟后，用ph为8.5，浓度为10mmol/l的tris-hcl配制成浓度为0.25nmol/l的目标产物，对应名称分别为mix1-1，mix1-2，mix1-3，mix1-4。s2：将配制好的目标产物磷酸化。利用t4多聚核苷酸激酶的寡核苷酸5’末端磷酸化，以便后面实验进行连接反应。磷酸化反应体系如下表所示，并在37℃水浴锅中反应30分钟。2.1mix2-1(μl)2.2mix2-2(μl)mix1-15mix1-35mix1-25mix1-45t4dnaligasebuffer2t4dnaligasebuffer2t4pnk(10000u/ml,neb)3t4pnk(10000u/ml,neb)3h2o5h205total20total20mix1-1与mix1-2连接并磷酸后，得到产物mix2-1；mix1-3与mix1-4连接后，得到产物mix2-2。s3：将磷酸化的目标产物退火。将磷酸化产物从水浴锅中取出后，按照下表所示的反应体系加入annealingbuffer，三蒸水定容到25μl，在pcr仪器上95℃反应20min，然后立即拿出放室温4小时静置。若不进行下步反应可将退火产物在冷却至室温以后放在-20℃保存，退火产物放置-20℃最好不超过2个月。mix2-1和mix2-2经退火反应后，分别得到mix3-1和mix3-2两种目的片段，如图3所示。s4：将载体质粒酶切，所形成的粘性末端与步骤s1中所加入的酶切位点序列对应，并回收酶切产物，得到载体片段。本实施例中所用的质粒为lentiviruvectorpll3.7通用载体质粒，购买自上海cpg生物科技有限公司，用noti-hf和xhoi限制性内切酶酶切形成粘性末端，酶切体系如下表，得到酶切载体的目的片段mix4-1。mix4-1酶切产物跑1％的琼脂糖凝胶电泳，恒压140v跑电泳25min，然后在紫外切胶仪下切回酶切后的载体条带。最后利用axgen凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体得到mix5-1。将步骤s3中得到的mix3-1和mix3-2分别取1μl，各加入300μl0.5xannealingbuffer，得到mix5-2和mix5-3。s5：将目的片段与载体片段连接，得到连接产物。载体片段的含量最好在50ng-100ng，本实施例中为50ng。连接反应在室温下进行2-4小时即可，本实施例中为3-4h，连接体系如下表。得到连接产物后，为检验连接成功与否，可进行下述操作。s6：将连接产物转化至宿主菌中，并进行抗性培养基培养。本实施例中宿主菌为大肠杆菌dh5a感受态细胞，转化方法为：1、制备含有amp抗生素的lb平板。lb培养基中100mg/ml的amp的含量为0.2％。2、取一个1.5ml无菌离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入连接产物。冰上静置20min。3、42℃水浴中热激120秒，然后迅速置冰上10min。整个过程不要振荡菌液。4、加入400μllb液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)30min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。5、3000rpm离心5min，去掉上清，留取50μl-80μl菌液，至含有抗生素amp的lb固体培养基上，涂布均匀。lb培养基中100mg/ml的amp的含量为0.2％。6、待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。s7：挑取s6中抗性培养阳性的菌株，置于含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃恒温摇床培养12-20h。利用axygen质粒小体试剂盒提取质粒，并进行pcr扩增后送测序，将测序结果与构建的目的质粒序列用snapgene生物软件进行序列对比分析。primerr，5'tgggaacatacgtcattattga3'，见seqidno:7；primerf，5'atatcccttggagaaaagcct3'，见seqidno:8。pcr体系及程序如下表：经大量比对结果证明，本方法构建的质粒准确率可达到80％以上。序列表<110>武汉科技大学<120>一种通过多聚核苷酸激酶构建长片段目的基因的方法及其应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>81<212>dna<213>目的基因序列(targetgenesequence)<400>1tcgaggtcgacggtatcgataagctcgcttcacgagattccagcaggtcgagggacctaa60ttaagggttccaagcttaagc81<210>2<211>81<212>dna<213>目的基因序列(targetgenesequence)<400>2ccagctgccatagctattcgagcgaagtgctctaaggtcgtccagctccctggattaatt60cccaaggttcgaattcgccgg81<210>3<211>41<212>dna<213>人工序列(primer)<400>3tcgaggtcgacggtatcgataagctcgcttcacgagattcc41<210>4<211>43<212>dna<213>人工序列(primer)<400>4cctgctggaatctcgtgaagcgagcttatcgataccgtcgacc43<210>5<211>40<212>dna<213>人工序列(primer)<400>5agcaggtcgagggacctaattaagggttccaagcttaagc40<210>6<211>38<212>dna<213>人工序列(primer)<400>6ggccgcttaagcttggaacccttaattaggtccctcga38<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列(primer)<400>7tgggaacatacgtcattattga22<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(primer)<400>8atatcccttggagaaaagcct21当前第1页12