预测血管紧张素ii受体拮抗剂类降压药作用的方法及应用的制作方法

专利名称:预测血管紧张素ii受体拮抗剂类降压药作用的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预测血管紧张素II受体拮抗剂类降压药药物作用的方法及其应 用，通过测定生物样品特定位点基因型，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物 作用。
背景技术：
高血压病是最常见的慢性疾病之一，是脑卒中、冠心病、糖尿病等的重大危险因 素，因此有效控制血压具有重要临床和公共卫生学意义。临床用于治疗高血压的药物有六 类，包括血管紧张素II受体(ATl-R)拮抗剂、β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI)、钙拮抗剂、α肾上腺素受体阻滞剂和利尿剂等。但是至今高血压的控制率较低，我 国和美国的资料表明，控制率分别仅为8. 和34%。这种低控制率不仅与降压药物本身 效力有关，而且与临床上缺乏有效的疗效预测指导系统有关。
现有临床用于预测降压药疗效、合理选择降压药物的方法，主要是医生经验性预 测和血压监测。这些方法过于粗略，医生难以根据患者个体差异进行药物的选择、配伍和定 量，以获得更好疗效、减少毒副作用，间接加重了患者的身心痛苦和经济负担。大量研究表 明，药物作用效应的个体差异与环境、遗传因素及其交互作用有关。药物基因组学是从基因 组水平探究药效的差异，揭示这些差异的遗传特征的前沿学科和高技术手段。其研究成果 可为医生拟定个体化用药方案，精确预测和提高药物疗效，降低药物毒副作用风险，从而降 低医疗费用，提高患者生活质量做出重要贡献。
据文献报道，药物基因组研究已经阐明了一些药物靶向的基因多态性与特定药物 作用间的关联关系，而这些成果导致的产品已经开始用于临床。例如，已在美国加利福尼亚 州批准上市的乳腺癌相关基因检测试剂盒(Oncotype DX )。该产品是用于预测患者对化 疗药物的反应性和耐药性的试剂盒(Science2004303 :1754_1755)。由于该试剂盒的特异 性和灵敏性较好，其检测项目已列为转移性乳腺癌化疗前必检项目，从而估计乳腺癌的复 发率。
原发性高血压相关基因至今已经发现超过70个，降压药物与基因多态性研究多 数集中在两者的交互效应对心血管事件发生的影响上[Drugs，2004 ；64(16) 1801-1816]。 例如已有报道，携带α-adducin基因460W等位子的高血压患者，采用利尿剂治疗比采用 其他降压治疗，更有助于降低患者心肌梗死和中风的发生几率。再如ACE插入/缺失的多 态性与血管紧张素酶原抑制剂(ACEI)存在交互作用，表现为不同基因型在血管紧张素受 体蛋白(ATI)的mRNA表达、左心室肥大、动脉硬化等方面的差异。
但是，与降压作用相关基因的研究十分有限[Drugs，2004 ;64 (16) :1801_1816]。 仅有的报道包括，一氧化氮合酶(NOE)基因多态性与利尿剂、α-adducin基因多态性与利 尿剂、G蛋白α-亚型基因多态性与β肾上腺素受体阻滞剂、以及ACE基因多态性与血管 紧张素II受体(ATl-R)拮抗剂等存在基因多态性与降压药疗效的关联关系。[0007]血管紧张素II受体I(ATl-R)拮抗剂(沙坦类药物)是临床最常用的一线降压药。 该类药物的作用机理是选择性地与ATl-R结合，抑制血管紧张素II的缩血管作用而使血压 下降。沙坦类药物除了用于高血压病的治疗，还因其保钾利钠作用特别适用于高血压伴随 充血性心力衰竭和肾功能衰竭患者的治疗。临床上常用的ATl—R类药物主要包括洛沙坦 (Losartan)、缬沙坦(Valsartan)、依贝沙坦(Irbesartan)、康得沙坦(Candesartan)、依普 沙坦(Eprosartan)、他索沙坦(Tasosartan)和替米沙坦(Telmisartan)等 。
尽管沙坦类药物作为临床较新推出的一线降压药物产品，虽然降压疗效可靠和副 作用较少，但也难以克服许多不足，如仍有部分患者对此类药物不敏感，表现为降压起效 慢、疗效差；少数病人出现了药物副作用，包括咳嗽及血管性水肿(与血管紧张素转化酶抑 制剂类药物相似，但发生率相对较低)、肝毒性和高血糖及贫血反应等。例如Reeves等对 2955名成年高血压患者依贝沙坦降压治疗的研究发现，约44%的患者未达到满意的临床 降压疗效(Hypertension. 1998 ;31 (6) 1311-6)。Guthrie R 等的研究也表明，连续 12 周、 150-300mg/d的依贝沙坦治疗疗程后，仅有约53%的患者降压疗效显著。
已有针对依贝沙坦的药物基因组学研究报道是一项瑞典的大型临床研究，即 SILVHIA试验。该研究陆续发现，肾素一血管紧张素一酸固酮系统通路中有多个基因的单核 苷酸多态性位点可能与依贝沙坦的降压疗效或左心室肥厚的改善作用有关联。该研究已报 道的基因包括，血管紧张素原基因、血管紧张素转化酶基因、血管紧张素II受体1基因和醛 固酮合成酶基因(Am J Hypertens. 2004 ； 17(1) 8-13. J Hypertens. 2001 ； 19 (10) 1783-7. J Hypertens. 2002 ；20 (4) 657-63. Am J Hypertens. 2002 ； 15 (5) 389-93.)。此外，与依贝 沙坦的药物反应可能有关的一些其他遗传多态性包括，载脂蛋白B基因(APOB)、LDL受体基 因(LDL-R)、转移生长因子基因(TGFi3 1)、前内皮素原基因(pr印roendothelin-l)和依贝 沙坦的主要代谢酶一细胞色素P450—2C9基因(CYP2C9) (BMC Cardiovasc Disord. 2004 28 ；4(1):16. Clin Cardiol. 2004 ；27 (5)287-90. Clin Cardiol. 2004 ；27 (3)169-73.J Hypertens. 2002 ；20 (10)2089-93.〕。
人体内同型半胱氨酸(Hcy，homosysteine)作为蛋氨酸代谢的中间产物，其本身 并不参与蛋白质的合成。蛋氨酸分子含有S甲基；在与三磷酸腺苷(ATP)作用生成S腺苷 蛋氨酸后，可通过各种转甲基作用，为体内已知的约50多种具有重要生理活性的物质提供 甲基。S腺苷蛋氨酸在甲基转移酶作用下将甲基转移至另一物质后，生成S腺苷同型半胱 氨酸，后者进一步脱去腺苷，生成同型半胱氨酸。同型半胱氨酸主要通过两条途径进行代 谢再甲基化途径和转硫途径。再甲基化途径约有50%同型半胱氨酸在蛋氨酸合成酶的 作用下，以维生素B12为辅因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，发生再甲基化，重新合成 蛋氨酸，参加体内蛋白质的代谢。这一反应中的甲基供体(N-5甲基四氢叶酸)是由N-5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，methylene tetrahydrofolate reductase)作用于 N-5，10-亚甲基四氢叶酸形成的。而此过程又是已知的体内能利用N5-甲基四氢叶酸的唯 一反应。故同型半胱氨酸与体内一碳单位代谢有着密切关系。另外，约50%的同型半胱氨酸 经也可通过转硫途径在胱硫醚β合成酶(CBS，cystathionine β-synthase)的催化下，与 丝氨酸缩合成胱硫酶，后者近一步生成半胱氨酸和α酮丁酸，此过程需要磷酸吡哆醛(活 性维生素Β6)作为辅助因子。[TIPS, 1990,11 =411-416]
血浆中的Hcy大部分通过二硫健与蛋白质结合，约占70%。由于Hcy与蛋白质的结合常成饱和状态，最大的结合力为140ymol/L，所以血浆中只有少量的游离Hey。不论是 结合形式或者游离形式的Hcy，都统称为总Hcy(tHCY，total homocysteine) Hcy是体内的 一种含硫氨基酸，近年来基础与临床研究均显示，它是心脑血管疾病独立的危险因素。高 tHCY血症可促发所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、肾功能损害、外周动 脉疾病等[心血管病学进展，2000，21 :29]。大量的事实表明轻微到中度tHCY血症(tHCY浓 度> 12umol/L，但< lOOumol/L)是动脉粥样硬化所致心血管疾病最广泛、最强的、独立的 危险因素。1997年人群调查表明，人群tHCY浓度偏高的地区，心血管疾病所致的死亡率增 力口。1998年对血浆tHCY浓度不同的人研究发现tHCY彡15umol/L较之于tHCY ^ IOumol/L 人群危险系数增加到1. 4。1998年对21520位年龄在35-64之间没有缺血性心肌病(IHD) 的人群研究，IHD 死亡率差异比(odds ratio)由 1 (tHCY<10. 25umol/L)增至 1.43(tHCY 介于 10. 25 与 12. 32umol/L)、1· 46 (tHCY 介于 12. 33 与 15. 16umol/L)及 2. 90 (tHCY 浓度 >15. 16umol/L)。每增加5umol/L tHCY，缺血性心肌病危险性增加33%，且与血中胆固醇 增加0.5nmol/L危险性相当。同时发现冠状动脉粥样硬化心脏病人同时伴有tHCY升高，死 亡率增加。慢性肾病病人，排泄HCY功能降低，血中tHCY增加，引起动脉粥样硬化，心血管 疾病死亡率增加。
Sutton 等[Circulation，1997，96 1745.]测量了 179 名单纯收缩期高血压 (SBP ≥ 160mmHg, DBP ≤ 90mmHg)的老年患者和 171 名对照者(SBP<160mmHg，DBPOOmmHg) 的血Hcy水平。发现前者血Hcy水平显著高于后者。在排除了混杂因素后，Hcy与SBP呈 正相关。认为血Hcy水平与单纯收缩期高血压独立相关。Kuhleova等[Am JHypertens, 2002，15 857]观察了 164名青少年原发性高血压和173名血压正常的对照者。发现2组 间血Hcy水平有显著差异，青少年原发性高血压与高Hcy水平相关，其中SBP与Hcy水平正 相关，与叶酸水平负相关。Lim等[Am J Epidemiol，2002，156 :1105_13]对Hcy和血压进 行了一项1994-1998的横断面调查，发现在调整了心血管危险因素后(肾功能、维生素B状 况、年龄、种族、收入、社会经济地位、体重指数、吸烟、绝经后状况、绝经后激素替代治疗、饮 酒、咖啡摄入、血脂、C-反应蛋白水平、维生素C、维生素E)，Hcy水平仍然与血压独立正相 关，Hcy每升高5umol/L，相应地，血压在男性升高0. 7/0. 5mmHg，在女性升高1. 2/0. 7mmHg。 在最高、最低Hcy水平间作进一步比较后发现，高水平Hcy使女性患高血压的危险性增加3 倍，男性患高血压的危险性增加2倍，认为高水平的Hcy可增加发生高血压的危险性。
高血压病患者中tHcy水平较高，可能是较易发生心、脑、肾等靶器官损害的一个 重要因素。并且体内叶酸、VB12水平与tHcy呈现负相关提示高血压患者补充叶酸、VB12可 能会延缓其靶器官的损害。对高血压病患者，特别是tHcy水平较高者，有规律地补充叶酸、 VB12可能会降低tHcy水平，从而延缓高血压病患者心、脑、肾等并发症的发生。
一项为期2年的随机、对照的临床实验证实，长期给予叶酸(5mg/日)及维 生素B6(250mg/日)以降低血液中同型半胱氨酸tHCY的含量，可以协同降低血压 [ArteriosclerThromb Vasc Biol,2001，212072—2079·]。
Hcy代谢关键酶活性改变是血中Hcy水平升高的重要因素。MTHFR是N5-甲基四 氢叶酸形成的关键酶，MTHFR基因C667T突变可致酶活性下降，使蛋氨酸循环障碍，血中Hcy 水平升高。有报道认为，Hcy代谢关键酶的基因多态性与单纯收缩期高血压的发生关系密 切。MTHFR可能是单纯收缩期高血压的易感基因，tHcy是单纯收缩期高血压的重要中间表型[中华心血管病杂志，2003，31 :269-273]。
MTHFR基因定位于染色体1ρ36. 3上，cDNA全长2. 2kb，编码一种黄素蛋白，是叶酸 代谢过程中一种重要的酶，其生化功能是催化从5，10—亚甲基四氢叶酸到5—甲基四氢叶 酸的还原反应。5—甲基四氢叶酸是一种甲基供体，参与多种重要的生物过程(如嘌呤、嘧 啶的合成)。它还与甲硫氨酸代谢中Hcy的复甲基化有关，MTHFR酶活性降低，会导致Hcy 在体内蓄积，而Hcy不仅与心血管疾病有关，而且具有胚胎毒性，可能是一种致畸性物质。 MTHFR缺陷与心血管疾病和先天畸形的发生有关。在已经发现的人类MTHFR基因突变中， 多数是可以导致酶活性严重下降甚至酶活性缺失的突变，在人群中罕见，而第677位核苷 酸的基因突变(C —T)引起该酶活性轻中度降低，同型半胱氨酸浓度增高[Circulation， 1996,94:3074-3078.]。而高同型半胱氨酸血症可造成血管内皮损伤和功能异常，刺激血管 平滑肌细胞增生，引起血管舒缩因子平衡紊乱，导致妊娠高血压综合征(PIH)。因此，多数研 究认为MTHFR基因是PIH的主要候选基因[中国公共卫生，2004，20，6 :762— 764]。而有研 究表明[中华心血管杂志，2000,28:239-240]，使用维生素B12、B6及叶酸可以降低几乎所 有原因引起的高Hcy水平。
甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR，Methionine synthase reductase)是蛋氨酸合 成酶的辅助因子，催化甲基钴胺再生[J Cardiovasc Risk，2000 ;7 197-200]，基因定位于 5P15. 2 15. 3，该基因包含15个外显子，大小从43bp到1213bp不等，含14个内含子，大 小从108bp到5kb不等[Gene, 1999 ；240 :75_88]。人类的编码序列包含2094个碱基对，编 码698个氨基酸的多肽，对于维持蛋氨酸和四氢叶酸在细胞内水平及维持Hcy在无毒性浓 度水平有重要作用，若MTRR发生变异，可能会引起Hcy血浆浓度升高。
高血压患者的降压疗效与Hcy通路的基因多态性有关。有研究表明[Thrombosis
Research2004,113 361-369]MTHFR C677T 的基因多态性与 ACEI 类降压药疗效有 关。对于444名中国的原发性高血压患者进行为期2周的ACEI类降压药物苯那普利的降 压治疗，结果提示MTHFR C677T基因型为TT的原发性高血压患者与基因型为CT或者CC的 患者相比较基础血压值明显增高，而且对于ACEI类降压药物的降压效果较好，尤其对于舒 张压的降压效果较好。
一项用于预测ACEI类降压药药效的方法已于2002年申请专利，专利申请号为 02123875. 8，公开号为CN1465712A。药物基因组学研究发现，携带MS基因919Asp等位子的 高血压患者，服用苯那普利后的降压幅度大，通过测定受试者的MS基因Asp919Gly多态性 位点基因型，可以预测ACEI类降压药降压作用。

发明内容
解决的技术问题
由于对药物反应存在个体差异，临床医生在选择药物至今缺少足够的个体化用药 依据，难以做到为病人提供“量体裁衣式”的药物配伍和剂量，不能即时、有效地控制血压和 毒副作用发生的风险，甚至可能延误治疗时机，造成患者健康和经济地双重损失。
鉴于上述不足，本发明旨在克服临床选择血管紧张素II受体I(ATl-R)拮抗剂或 者研制与之组合的新组合物时的盲目性，为个体化用药提供一种预测血管紧张素II受体 1 (ATl-R)拮抗剂类药物药物作用的方法、试剂盒及其应用，便于指导临床用药。[0024]技术方案
为实现上述发明目的，采取以下技术方案
一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用的方法，该方法是 通过测定生物样品同型半胱氨酸代谢通路基因的N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因 Ala222Val (C667T)多态性，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用
a)N-5,10_亚甲基四氢叶酸还原酶基因型为222Val/Val纯合型时，预测女性患者 对血管紧张素II受体1拮抗剂的降压作用好；
b)N-5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因型为222Ala/Ala纯合型时，预测女性患者 对血管紧张素II受体1拮抗剂的降压作用差。
一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用的方法，该方法是通 过测定生物样品同型半胱氨酸代谢通路基因的甲硫氨酸合成酶还原酶基因Ile22Met多态 性，预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用
a)甲硫氨酸合成酶还原酶基因型为22Met/Met纯合型或22Ile/Met杂合子时，预 测轻度高血压患者对ATl受体拮抗剂的降压作用好；
b)甲硫氨酸合成酶还原酶基因型为22Ile/Ile纯合型时，预测轻度高血压患者对 ATl受体拮抗剂的降压作用差。
上述测定同型半胱氨酸代谢通路基因多态性位点基因型所采用的方法选自PCR、 基因芯片、基因测序、基因扫描、Taqman等生物检测方法中的一种。PCR、基因芯片、基因测 序、基因扫描基因型检测方法是本领域技术人员常规使用的方法，Taqman技术是一种运用 荧光技术实时定量PCR的方法，具体操作过程见本发明实施例1。其中优选的检测方法为 PCR 或 Taqman 技术。
上述生物样品为血样、口腔粘膜试子、唾液样本、尿样中的一种。其中，优选的生物 样本为外周全血或者血细胞样本。
上述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药选自依贝沙坦(Irbesartan)、洛 沙坦(Losartan)、缬沙坦(Valsartan)、替米沙坦(Telmisartan/Micardis,泰米沙坦)、 坎地沙坦(Candesartan，康得沙坦)、依普沙坦(Eprosartan，依普罗沙坦)、奥美沙坦 (OlmesartanMedoxomi 1，奥美沙坦酯)、他索沙坦(Tasosartan/Verdia)及它们的活性代谢 产物、盐类或酯类中的一种。其中优选依贝沙坦或洛沙坦，它们是血管紧张素II受体1拮 抗剂类降压药物中常用的、具有代表性的药物。
一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的试剂盒，包括测定受 检核酸模板的同型半胱氨酸代谢通路基因多态性位点基因型的试剂，其中含有PCR反应试 剂，限制性内切酶酶切反应试剂或Taqman反应试剂和特异性探针。所述同型半胱氨酸代谢 通路上的关键酶的基因优先为N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因和/或者甲硫 氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因。
一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的试剂盒，包括测定生物 样品的核酸模板的N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性位点基因型的试剂，其中有 PCR反应试剂、限制性内切酶酶切反应试剂或Taqman反应试剂、特异性探针。
其中PCR反应试剂含有如下特定引物序列
正向引物5，GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT3，，序列表1 (SEQ IDNo. 1)[0039]反向引物5，TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT3，，序列表2 (SEQIDNo. 2)
或
正向引物5，CAAAGGCCACCCCGAAGC-3，，序列表 3 (SEQ ID No. 3)
反向引物5，AGGACGGTGCGGTGAGAGTG3，，序列表4 (SEQ IDNo. 4)
其中特异性探针为检测N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性位点的野生 型探针和突变型探针，它们的序列分别为
野生型探针5，ATGAAATCGGCTCCCGC3，，序列表5 (SEQ IDNo. 5)
突变型探针5，ATGAAATCGACTCCCGC3，，序列表6 (SEQ ID No. 6)
其中生物样品中核酸模板的试剂，PCR反应试剂，限制性内切酶酶切反应试剂或 Taqman反应试剂中未特别指明的试剂是本领域技术人员常规使用的试剂。
其中所检测的生物样品种类为血样、口腔粘膜试子、唾液样本、尿样中的一种或几 种。其中所述检测的血样本为外周全血或者血细胞样本。
上述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药选自依贝沙坦、洛沙坦、缬沙坦、替米 沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奥美沙坦、他索沙坦及它们的活性代谢产物、盐类或酯类中的一 种。
上述预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用，为预测血管紧张素II 受体1拮抗剂类降压药降压作用。
一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的试剂盒，包括测定生物 样品的核酸模板的甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性位点基因型的试剂，其中有PCR反应 试剂、限制性内切酶酶切反应试剂或Taqman反应试剂、特异性探针。
其中PCR反应试剂含有如下特定引物序列
正向引物5，CCTAGGTCAGACCAGAGCTAATCC3，，序列表7(SEQ ID No. 7)
反向引物5，GGCCCTACCTTGAAATCCATCAG3，，序列表8 (SEQ ID No. 8)
或
正向引物5，GCCTGTAAGTCCTAGCTACTCC3，，序列表9 (SEQ ID No. 9)
反向引物5，GAATATTTTAATTTCCCAGTGC3，，序列表10 (SEQ ID No. 10)
其中特异性探针为检测甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性位点的野生型探针和 突变型探针，它们的序列分别为
野生型探针5，ATGTACAATGCCATGTCCAA3，，序列表11 (SEQ ID No. 11)
突变型探针5，ACAATGCCGTGTCCAA3，，序列表12 (SEQ ID No. 12)
其中生物样品中核酸模板的试剂，PCR反应试剂，限制性内切酶酶切反应试剂或 Taqman反应试剂中未特别指明的试剂是本领域技术人员常规使用的试剂。
其中所检测的生物样品种类为血样、口腔粘膜试子、唾液样本、尿样中的一种或几 种。其中所述检测的血样本为外周全血或者血细胞样本。
上述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药选自依贝沙坦、洛沙坦、缬沙坦、替米 沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奥美沙坦、他索沙坦及它们的活性代谢产物、盐类或酯类中的一 种。
上述预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用，为预测血管紧张素II 受体1拮抗剂类降压药降压作用。[0064]本发明提供的试剂盒预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用，其过程 包括(a)从取自受检外周微量血样品中提取核酸模板；(b)用PCR方法扩增PRCP基因上的 特异片断；(c)用限制性内切酶对PCR产物进行酶切；(d)同时用阳性对照模板进行(b) (c) 步骤；(e)电泳分离酶切产物，根据阳性模板的带型特点鉴定并且判断结果。
本发明提供的试剂盒预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用，其过程 包括(a)从取自受检外周微量血样品中提取核酸模板；(b)用Taqman方法扩增PRCP基因 上的特异片断；(c)鉴定并判断结果。
一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用的方法，该方法是通过 测定生物样品同型半胱氨酸代谢通路基因多态性位点基因型，预测血管紧张素II受体1拮 抗剂类降压药的降压作用。本发明的方法还可在药物研发中的应用。
上述应用是指根据同型半胱氨酸代谢通路基因多态性位点基因型预测血管紧张 素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用，设计出同型半胱氨酸代谢通路调节剂以增强血管 紧张素II受体1拮抗剂类药物降压作用增强的复方药，所述复方药包括选择性或非选择性 的血管紧张素II受体拮抗剂和同型半胱氨酸代谢通路调节剂。所述的同型半胱氨酸代谢 通路调节剂包括涉及同型半胱氨酸代谢通路中及其上游、下游和旁路的各种代谢酶、辅助 因子、辅酶、中间产物以及它们的替代剂、激动剂或者阻滞剂。
一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的药物作用的方法，该方法是通过 测定生物样品同型半胱氨酸代谢通路MTHFR基因和/或MTRR基因多态性位点的基因型，预 测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用。本发明的方法还可在药物研发中的应用。
上述应用是指根据同型半胱氨酸代谢通路MTHFR基因和/或MTRR基因多态性位 点的基因型预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药的降压作用，设计出同型半胱氨酸代 谢通路调节剂以增强血管紧张素II受体1拮抗剂类药物降压作用增强的复方药，所述复方 药包括选择性或非选择性的血管紧张素II受体拮抗剂和同型半胱氨酸代谢通路调节剂。 所述的同型半胱氨酸代谢通路调节剂包括涉及同型半胱氨酸代谢通路中及其上游、下游和 旁路的各种代谢酶、辅助因子、辅酶、中间产物以及它们的替代剂、激动剂或者阻滞剂。
本发明是以多年的药物基因组学研究为基础。通过给高血压患者服用依贝沙坦进 行降压治疗，考察遗传因素和药物疗效的关系。依贝沙坦是血管紧张素II受体1拮抗剂类 降压药物中的一种，选择性地与ATl — R结合，抑制Ang II的血管收缩作用从而使血压下 降，临床用于降压治疗。依贝沙坦的半衰期较长(约为19小时)，因此适宜于每日服药一 次，常用剂量为150—300mg/天，临床广泛用于治疗轻、中度高血压病。
本发明中研究的基因多态性是同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶的基因多态性。 本发明中研究的同型半胱氨酸代谢通路上的关键酶为N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基 因和/或者甲硫氨酸合成酶还原酶基因。
MTHFR基因定位于染色体1ρ36. 3上，cDNA全长2. 2kb，编码一种黄素蛋白，其生化 功能是催化从5，10-亚甲基四氢叶酸到5-甲基四氢叶酸的还原反应。5-甲基四氢叶酸是 一种甲基供体，参与多种重要的生物过程(如嘌呤、嘧啶的合成)。它还与甲硫氨酸代谢中 同型半胱氨酸的复甲基化有关，MTHFR酶活性降低，会导致HCY在体内蓄积，而HCY不仅与 心血管疾病有关，而且具有胚胎毒性，可能是一种致畸性物质。MTHFR缺陷与心血管疾病和先天畸形的发生有关。
高同型半胱氨酸血症可促进所有重要的心脑血管疾病发生，包括冠心病、脑卒中、 肾功能损害、外周动脉疾病等。高血压病患者中tHCY水平较高，可能是较易发生心、脑、肾 等靶器官损害的一个重要因素。并且体内叶酸、VB12水平与HCY呈现负相关，提示高血压 患者补充叶酸、VB12可能会延缓其靶器官的损害。对高血压病患者特别是tHCY水平较高 者有规律地补充叶酸、VB12可能会降低tHCY水平，从而延缓高血压病患者心、脑、肾等并发 症的发生。
本发明渉及的研究发现:
高血压病人经血管紧张素II受体1拮抗剂类药物治疗后，在服药后第28天，基 因型为222Val/Val (TT)纯合型与基因型为222Ala/Ala (CC)纯合型的等位基因携带者相比 较，降压作用较好。提示MTHFR基因Ala222Val (CT)多态性基因型和ATl受体拮抗剂类的 降压作用有关。
高血压病人经血管紧张素II受体1拮抗剂类药物治疗后，在服药后第28天，基因 型22Met/Met(GG)等位基因携带者或者22Ile/Met (AG)杂合型等位基因携带者的降压作用 较基因型22Ile/Ile(AA)纯合型的降压作用好，提示MTRR基因Ile22Met (A145G)多态性和 ATl受体拮抗剂类的降压作用有关。
MTHFR基因和/或MTRR基因的基因型，作为预测血管紧张素II受体1拮抗剂类抗 高血压药物作用的指示系统之一，可以指示并定性和定量地预测血管紧张素II受体1拮抗 剂类降压药的药物作用，指导临床医生个体化用药。
MTHFR基因和/或MTRR基因的基因型，作为预测血管紧张素II受体1拮抗剂类抗 高血压药物的指示系统之一可以指示这两个基因多态性对应的代谢(酶)活性/功能状 态或靶器官功能状态，作为新药的功能靶点，指导复方降压药物的研发；并可以指示结合研 制的复方降压药物，更合理选择血管紧张素II受体1拮抗剂类药物的个体最适剂量和最适 复合药物的配伍。
有益效果
本发明提供了利用功能基因预测ATl受体拮抗剂类抗高血压药物疗效的一种方 法，可作为ATl受体拮抗剂类降压药药效的指示系统，通过测定同型半胱氨酸代谢通路上 关键酶基因的多态位点基因型，预测ATl受体拮抗剂类降压药疗效。根据同型半胱氨酸代 谢通路上关键酶基因的多态性基因型，设计出通过调节同型半胱氨酸代谢通路上关键酶的 功能，明显增强ATl受体拮抗剂降压作用的复方药，便于医生在用药时根据个体差异进行 选择，提高了临床用药和治疗的有效率与安全性，降低了发生毒副作用的风险和经济负担。 本发明通过测定基因型，指导新药研发形成一组ATl受体拮抗剂复合新药，特别对于目前 治疗效果不佳的患者，提供了更好的选择。应用这类功能基因多态性的发明成果，对今后更 加经济有效地指导抗高血压药物的临床选药、预测用药疗效和指导新药研制具有产业与服 务的应用价值。
具体实施方式
实施例1 测定MTHFR基因的Ala222Val多态性位点并预测ATl受体拮抗剂类降 压药硝苯地平的降压作用[0082](一 )测定MTHFR基因的Ala222Val多态性位点基因型
(1)提取宿主细胞的基因组DNA
(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇勻，室温静置10分钟，期间，摇动数 次，彻底裂解红细胞；
(b)于4°C、2000转离心/分，10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打 散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，摇勻，加白细胞裂解液置15ml，混勻37°C水浴20分钟后取 出，置冷水中；
(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混勻后放在一 20 V冰箱5分钟，取出于4°C、3000转/ 分离心10分钟。将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA 絮状物析出；
(d)将析出的DNA絮状物移至另一 1. 5ml已装入75%乙醇的滤纸上，使液体挥发干。
(e)加DNA水化液1. 5ml，置摇床，摇动过夜，备用；
(f) DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的 OD值，以0D260nmX 50所得值为DNA浓度。并以0D260nm/0D280nm比值估计DNA纯度；
(2)使用Taqman方法检测Val7Met多态位点基因型
(a)用PCR仪扩增MTHFR功能基因多态位点及其侧翼序列，在5ul PCR反应体系中 含有基因组 DNA10ng，2. 5ul 的 TaciMan2X Universal PCR Master Mix No AmpEraseUNG (组
=AmpliTaq Gold DNA Polymerase, dNTPs with Dutp, PassiveReference, /)MX 化的缓冲液)，及0. 72uM的正向引物，0. 72uM的反向引物及两段带荧光报告集团的等位基 因特异性探针各0. 16uM，剩下用ddH20补足反应体系。
引物序列为
正向引物5，GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT3，，序列表1 (SEQ IDNo. 1)
反向引物5，TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT3，，序列表2 (SEQ IDNo. 2)
等位基因特异性探针的序列为
VIC-5，ATGAAATCGGCTCCCGC，-NFQ，序列表 5 (SEQ ID No. 5)
对应于“G (或Ala)，，等位基因，携带VIC荧光报告基团。
FAM-5，ATGAAATCGACTCCCGC，-NFQ,序列表 6 (SEQ IDNo. 6)
对应于“A (或Val) ”等位基因，携带FAM荧光报告基团。
PCR反应条件
95 "C IOmin, 1 个循环
92"C15s,50 个循环
60 "CImin，50 个循环
(b)在7900型荧光定量PCR仪上检测荧光信息
将完成PCR反应的PCR板放入7900型荧光定量PCR仪上，选用 “AllelicDiscrimination”程序，进行扫描与结果的判断
发出FAM荧光者的基因型为Val/Val纯合子；
发出VIC荧光者的基因型为Ala/Ala纯合子；
发出两种荧光者的基因型Ala/Val杂合子。[0109](二)、预测药效:
基因型为222Val/Val (TT)纯合型时，女性患者对ATl受体拮抗剂类降压药药效的 降压作用较大；
基因型为222Ala/Ala(CC)纯合型时，女性患者对ATl受体拮抗剂类降压药药效的 降压作用较小。
以上方法通过临床验证，先将高血压病人分为三组纯合野生型组、杂合型组、纯 合突变型组，分别给予伊贝沙坦28天，观察其降压作用，结果如下
在女性高血压病人服用伊贝沙坦后第28天的收缩压(SBP)和舒张压(DBP)降压 效果在222Val/Val (TT)纯合型携带个体中显著高于222Ala/Ala(CC)基因型，提示MTHFR 基因Ala222Val (CT)多态性基因型和伊贝沙坦的降压作用有关(见表1)。
表IMTHFR基因Ala222Val多态位点与伊贝沙坦的降压作用的关系
权利要求
1.一种预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药药物作用的试剂盒，包括测定生物 样品的核酸模板的N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因Ala222Val多态性位点基因型的试 齐U，其中有PCR反应试剂、限制性内切酶酶切反应试剂或Taqman反应试剂、特异性探针，所 述PCR反应试剂含有如下特定引物正向引物5’ GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT 3’反向引物5，TGTGTCAGCCTCAAAGAAAAGCT3，。
2.如权利要求
1所述的试剂盒，其中特异性探针为检测N-5，10-亚甲基四氢叶酸还原 酶基因Ala222Val多态性位点的野生型探针和突变型探针。
3.如权利要求
2所述的试剂盒，其中特异性探针序列分别为野生型探针5，ATGAAATCGGCTCCCGC 3，；突变型探针5’ ATGAAATCGACTCCCGC 3，。
4.如权利要求
1所述的试剂盒，其中所检测的生物样品种类为血样、口腔粘膜试子、唾 液样本、尿样中的一种或几种。
5.如权利要求
4所述的试剂盒，其中所述检测的血样本为外周全血或者血细胞样本。
6.如权利要求
1所述的试剂盒，其特征在于所述的血管紧张素II受体1拮抗剂类降 压药选自依贝沙坦、洛沙坦、缬沙坦、替米沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、奥美沙坦、他索沙坦及 其活性代谢产物、盐类或酯类中的一种。
7.如权利要求
1所述的试剂盒，其特征在于所述预测血管紧张素II受体1拮抗剂类 降压药药物作用，为预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药降压作用。
专利摘要
本发明提供一种预测试剂盒，包括测定受检核酸模板的同型半胱氨酸代谢通路基因多态性位点基因型的试剂，利用PCR-RFLP方法或者Taqman方法，检测快速、安全、方便、灵敏、结果可靠，可预测血管紧张素II受体1拮抗剂类降压药降压作用，并预测原发性高血压患者的靶器官功能状态，便于医生在用药时根据个体差异进行选择，提高了临床用药和治疗的效率与安全性，降低了发生毒副作用的风险和经济负担。
文档编号C12Q1/68GKCN1858240 B发布类型授权 专利申请号CN 200510011679
公开日2011年6月15日 申请日期2005年4月30日
发明者刘学, 唐根富, 张善春, 张岩, 徐希平, 李志平, 毛广运, 洪秀梅, 王滨燕, 王琳琳, 蒋善群, 邢厚恂 申请人:安徽省生物医学研究所, 深圳奥萨医药有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (2),