确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法
【专利说明】确定细胞样品中朝核酸存在或不存在的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及检测含有细胞的液体样品中靶核酸存在或不存在的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 为检测靶核酸存在或不存在，现有技术中已知几种方法是基于捕获包含待检测靶 核酸的杂交体，在此称为杂交捕获检测（hybrid capturing assay)。各技术的基础描述于， 例如WO 93/10263,进一步的发展描述于WO 2010/127223。各技术用于检测和表征特定的 核酸序列和序列改变，例如检测指示感染的病毒或细菌核酸序列存在或不存在、疾病和癌 症相关的哺乳动物基因的等位基因的变体的存在和法医样品中发现的核酸来源的鉴定，以 及胎儿诊断，例如亲子鉴定。基于杂交体捕获的所述技术得到广泛应用，可用于检测DNA或 RNA(反向杂交捕获），特别是在临床诊断领域。FDA批准的检测是digene HC2HPV DNA测 定，它采用手动转换程序处理两种PRESERVCYT?.和SUREPATH? LBC介质，以便后续 通过digene HC2High-Risk HPV DNA测定进行测试。相应手工方案需要耗时、手动的转换 方法，包括许多重复的动作。为收集临床样品中的细胞，必须将它们离心，必须除去上清液， 然后制备细胞以供随后的测定。每天处理500至2500份样本的高容量实验室由于重复的 手工步骤而面临大量的人体工程学相关损伤，例如腕管综合症，该情况在较低容量的实验 室中也有较低程度的存在。因此，本领域非常需要能避免手动步骤以及样品制备的自动化。
[0004] 为各杂交捕获检测准备样品的自动化方法由QIAGEN公司以QIASYMPHONY? AXpH DNA程序为名所开发。这是基于阴离子交换层析的DNA提取方案，根据所使用的细 胞学介质，可以在4. 5至6. 5小时中自动制备最多96个样本。由于甲醛固定作用，收集在 SUREPATH?介质中的样品需要延长细胞溶解时间的改进方案并添加蛋白酶K以从甲醛 凼定的SIJREPATH?样品纯化DNA。这延长的运行时间使得客户无法在一个班期（8小时） 内处理满盘的88个样本以及校准品和对照品，包括he检测。因此，客户的以下需求仍未解 决，即，以高通量HPV测试实现更快的周转时间，并减少人工干预的次数。
[0005] 本发明的目的是提供快速和适于自动化地检测细胞样品中靶核酸存在或不存在 的方法。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明提供了一种快速和可自动化的方法，其中将细胞，如源自宫颈拭子样品的 上皮细胞，结合到阴离子交换表面，从而将其自周围的液体介质中收集。本发明特别适合于 从液基细胞学介质中收集细胞。细胞以高亲和力和快速动力学特性直接结合于阴离子交换 表面，所述阴离子交换表面优选由携带阴离子交换部分的磁性颗粒提供。结合于阴离子交 换表面的细胞易于从周围介质中分离，并且可以直接重悬于适合后续杂交捕获测定的组合 物，进行该测定以检测核酸，例如病原体核酸，特别是病毒核酸或细胞核酸。此外，令人惊讶 地发现，不必在进行杂交捕获测定之前主动除去、各自分开阴离子交换表面。这显著减少了 必要的准备步骤。因此，本发明的方法相对于现有的手动或自动样品制备方法提供了相当 大的改进，因为它是快速、自动化的，并且只需要少量的准备步骤。与现有技术的方法相比， 无需耗时的手工细胞制备步骤，此外，无需特殊的预处理，如调整结合条件。这节省了化学 (试剂），且优点还在于，机器人系统的整体操作容量可用于样品容积。如实施例所示，该方 法提供了可靠的结果，并且不易出错，这是诊断学领域的重要特征。因此，本发明提供了一 种针对上述客户需求的解决方案。
[0008] 根据第一个方面，提供了测定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法，所述方法 包括：
[0009] a)在适合诱导所述细胞和所述表面之间结合的条件下，将包含阴离子交换部分的 表面与细胞样品接触；
[0010] b)将含有结合细胞的表面与剩余样品分开以收集细胞；
[0011] C)从细胞释放核酸；
[0012] d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间形成杂交体；
[0013] e)检测所述杂交体的存在或不存在。
[0014] 如实施例所示，该方法能够快速制备用于杂交捕获测定的细胞样品进而能够快速 进行杂交捕获测定。该方法可靠、快速、适合于自动化。因此，它特别适用于诊断领域。此 夕卜，该方法对于高通量领域特别有用。
[0015] 还提供了用于本发明方法的试剂盒，它包括：
[0016] a)磁性粒子，其中，所述磁性粒子的表面包含阴离子交换部分；
[0017] b)变性剂，其是含有碱，优选NaOH或KOH的碱性溶液；和
[0018] c)含有离液剂和选自螯合剂、缓冲剂和防腐剂的任选的一种或多种添加剂的组合 物。
[0019] 相应的试剂盒用于快速制备用于杂交捕获测定的细胞样品。优选地，所述试剂盒 以药盒的形式提供，其中所述试剂盒组分a)到c)包括在所述药盒的单独槽中。相应的药 盒适用于能够处理磁性颗粒的机器人系统。
[0020] 还提供了用于进行杂交捕获测定的试剂盒，其包括：
[0021] a)磁性粒子，其中，该磁性粒子的表面包含阴离子交换部分；
[0022] b)至少一种适合与靶核酸杂交的探针；和
[0023] c)至少一种能够结合双链核酸杂交体的粘合剂。
[0024] 本领域技术人员从以下描述和所附权利要求会明白本申请的其它目的、特征、优 点和各方面。然而，应当理解，以下描述、所附的权利要求书，和具体的实施例虽然显示了本 申请的优选实施方式，但这些仅是通过举例说明的方式给出。通过阅读下文，本领域技术人 员容易理解本发明所公开的构思和范围内的各种变化和修改。
[0025] 附图简述
[0026] 图1 :手动AXpH-direct和手动转换I的比较。显示的HPV测定结果（RLU/CO[MW]) 是应用不同的珠悬浮液I-VII的HPV阴性临床样本的结果。手动转换（MC)作为参比。
[0027] 图2 :手动AXpH-direct和手动转换II的比较。显示的HPV测定结果（RLU/CO[MW]) 是应用不同的珠悬浮液I-VII的HPV阳性临床样本的结果。手动转换（MC)作为参比。
[0028] 图3 :AXpH-direct对于自动化I的适应性。显示的HPV测定结果（RLU/CO[MW])是 采用了手动转换（MC)作为参比、手动AXpH-direct方案和自动化AXpH-direct方案的HPV 阴性临床样本的结果。
[0029] 图4 :AXpH-direct对于自动化II的适应性。显示的HPV测定结果（RLU/CO[MW]) 是采用了手动转换（MC)作为参比、手动AXpH-direct方案和自动化AXpH-direct方案的 HPV阳性SiHa细胞培养的结果。
[0030] 图5 :AXpH-direct对于自动化III的适应性。显示的HPV测定结果（RLU/CO[MW]) 是采用了手动转换（MC)作为参比、手动AXpH-direct方案和自动化AXpH-direct方案的来 自临床库（库1)的HPV阳性样品的结果。
[0031] 图6 :AXpH-direct对于自动化IV的适应性。显示的HPV测定结果（RLU/CO[MW]) 是采用了手动转换（MC)作为参比、手动AXpH-direct方案和自动化AXpH-direct方案的另 一临床库（库2)的HPV阳性样品的结果。
[0032] 图7 :AXpH-direct对于Preservcytk和81)1^卩八1^|<.样品的适应性。显示 的HPV测定结果（RLU/CO)是采用了手动转换（MC)作为参比、手动AXpH-direct方案或自动 化AXpH-direct方案的不同HPV阳性（临床库）和阴性临床样品（阴性库）以及HPV阳性 细胞培养物（细胞）的结果。所述样品含有PRESERVCYT? (PC)或SUREPATH? (SP) 培养基。
[0033] 图8 :负责细胞与珠 I结合的参数。显示的HPV测定结果（RLU/CO)是应用不同的 细胞与珠结合条件下（pH 5、7或9, iPrOH=异丙醇）的珠部分和上清液部分（SN)的结果。 利用PEI改性珠或二氧化硅珠 （MAS G)。
[0034] 图9 :负责细胞与珠 II结合的参数。显示的HPV测定结果（RLU/CO)是应用不同 的细胞与珠结合条件下（pH 5、7或9, iPrOH=异丙醇）的珠部分和上清液部分的结果。利 用DEAPS改性珠或二氧化硅珠 （MAS G)。
[0035] 图10 :负责细胞与珠 III结合的参数。显示的HPV测定结果（RLU/CO)是应用不 同的细胞与珠结合条件下（pH 5、7或9, iPrOH=异丙醇）的珠部分的结果。比较了 PEI改 性珠和DEAPS改性珠。
[0036] 图11 :HPV测定结果I的一致性。显示的HPV测定结果（RLU/CO = 0, 1-10, 000) 是72份个体样品的复制品。为在手动转换（MC)和手动AXpH-direct方案之间作比较，将 各RLU/CO值描绘成x-y图。r 2是相关系数。
[0037] 图12 :洗脱缓冲液的影响。显示的所得HPV测定结果（RLU/CO [MW])是将2000 μ 1 或700 μ 1样本应用于自动化AXpH-direct方案（分别是QS-SP-2000 μ 1方案或者700 μ 1 方案）和施加 STM/DNR或NaOH作为洗脱缓冲液的结果。手动转换（MC)作为参比。
[0038] 图13 :负责细胞与珠 IV结合的参数。显示的HPV测定结果（RLU/CO)是应用不同 的细胞与珠结合条件下（pH 5、7或9, iPrOH=异丙醇）的珠部分的结果。比较PEI改性珠 和DEAPS改性珠。手动转换（MC)与700 μ 1的样品输入用作参比。
[0039] 图14 :细胞结合过程中电导率的影响。显示的HPV测定结果（RLU/CO)是在细胞 与PEI改性珠结合过程中应用不同浓度的KH 2PO4 (O-IOOOmM)的洗脱液部分和上清液部分的 结果。手动转换（M