放的核酸进行变性； d) 在靶核酸和该靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中步骤d)包括： -在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的 条件下，将含有释放且变性的核酸的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触，其 中优选形成RNA/DNA杂交体； -利用结合该双链核酸杂交体的结合剂捕获所述双链核酸杂交体； -任选地将所捕获的双链核酸杂交体与未结合的核酸分离； -任选地洗涤该捕获的双链核酸杂交体； e) 检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示靶核酸的存在或不存在。
15. 如权利要求1-14中一个或多个，特别是权利要求3所述的方法，其特征在于，包括 以下步骤： a) 在适合于诱导细胞和所述表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与 细胞样品接触，其中所述阴离子交换部分包含至少一种伯胺、至少一种仲胺和/或至少一 种叔胺基团，其中细胞结合发生在选自以下pH范围的pH值下：3. 5-8、3. 75-7. 75、4-7. 5、 4. 25-7. 25或4. 5-7,其中所述阴离子交换部分的氨基在所述pH值下带正电，其中不对结合 条件作调整； b) 将结合有细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞； c) 将所收集的阴离子交换表面结合细胞与促进核酸从细胞释放的液体组合物接触，其 中所述液体组合物具有一种或多种，优选至少两种，至少三种，更优选所有的以下特征i到 V： i. 它包含一离液剂； ii. 它具有碱性pH值； iii. 它具有的pH值选自：pH12或更高、pH12. 5或更高、pH13或更高、或pH13. 25 或更高； iv. 它包含一种或多种添加剂，优选 aa)螯合剂；bb)缓冲剂；和/或 cc)防腐剂 和/或 v.所述液体组合物通过将两种或多种组合物混合获得，其中所述组合物之一包含离 液剂，所述组合物之一是包含碱性试剂（优选NaOH或KOH)的碱性溶液，浓度优选1. ON至 2. ON； 和从细胞释放核酸并使释放的核酸变性，其中，优选进行加热步骤以促进核酸的释放 和/或变性； d) 在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中步骤d)包括： -在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放 且变性的核酸的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触，其中优选形成RNA/DNA杂交 体； -利用结合该双链核酸杂交体的结合剂捕获所述双链核酸杂交体； -任选地将捕获的双链核酸杂交体与未结合的核酸分离； -任选地洗涤该捕获的双链核酸杂交体； e) 检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示所述靶核酸的存在或不存在。
16.如权利要求1-14中一个或多个，特别是权利要求3和/或权利要求9所述的方法， 其特征在于，包括以下步骤： a)在适合于诱导细胞和所述表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与 细胞样品接触，其中所述阴离子交换表面由包含阴离子交换部分的磁性颗粒提供，其中细 胞结合发生在选自以下pH范围的pH值下：3. 5-8、3. 75-7. 75、4-7. 5、4. 25-7. 25或4. 5-7， 其中所述阴离子交换部分的阴离子交换基团在所述pH值下带正电，其中优选不对结合条 件作调整； b) 将结合有细胞的磁性颗粒与剩余样品分离以收集细胞； c) 将所收集磁性颗粒结合细胞与促进核酸从细胞释放的液体组合物接触，其中所述液 体组合物具有一种或多种，优选至少两种，至少三种，更优选所有的以下特征i到v: i. 它包含一离液剂； ii. 它具有碱性pH值； iii. 它具有的pH值选自：pH 12或更高、pH 12. 5或更高、pH 13或更高、或pH 13. 25 或更高； iv. 它包含一种或多种添加剂，优选 aa)螯合剂； bb)缓冲剂；和/或cc)防腐剂 和/或 v. 所述液体组合物通过混合两种或多种组合物获得，其中所述组合物之一包含离液 剂，所述组合物之一是包含碱性试剂（优选NaOH或K0H)的碱性溶液，浓度优选1. ON至 2. ON； 和从细胞释放核酸并使释放的核酸变性，其中，优选进行加热步骤以促进核酸的释放 和/或变性； d) 在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中未在步骤d)之前磁性分离 磁性颗粒，其中步骤d)包括： -在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放 且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接 触； -利用结合该双链核酸杂交体的第一结合剂捕获所述双链核酸杂交体，藉此形成双链 核酸杂交体/第一结合剂复合物； -将双链核酸杂交体/第一结合剂复合物与未结合的核酸分离，藉此也除去至少一部 分磁性颗粒； -使该复合物与标记有可检测标记物的另一结合剂结合以形成双链核酸杂交体/第一 结合剂/标记的结合剂复合物； -洗涤该双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物，其中所述洗涤除去剩余 的磁性颗粒，如果仍存在的话； e) 检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示所述靶核酸的存在或不存在。
17. 如权利要求1-16,特别是权利要求14-16中一个或多个所述的方法，其特征在于， 包含阴离子交换部分的表面由包含聚乙烯亚胺作为阴离子交换部分的磁性颗粒提供，其 中，在步骤a)中将磁性颗粒与细胞样品接触后，所述磁性颗粒包含在所得混合物中的浓度 优选为：50yg/ml- 2000yg/ml、75yg/ml- 1750yg/ml、100yg/ml-1500yg/ml、125yg/ ml- 1250yg/ml和 150yg/ml- 1100yg/ml。
18. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，所收集的磁性颗粒结合细胞 与选自下组的体积的所述液体组合物接触：50y1-200y1、60y1-175y1、70y1-150y1、 80y1-125yl和85y1-100yl，其中所述液体组合物包含离液剂，具有的pH值选自：pH12 或更高、pH12. 5或更高、pH13或更高、或pH13. 25或更高。
19. 如权利要求1-18中一个或多个所述的方法，其特征在于，具有一种或多种，优选至 少两种，更优选至少三种的以下特征i到ix: i. 所述方法是用于分析临床样品的疾病状态和/或用于确定在临床样品中病原体的 存在或不存在的自动化方法； ii. 待检测的靶核酸是病原体核酸； iii. 待检测的靶核酸是病毒核酸； iv. 待检测的靶核酸是HPV核酸； v. 所述方法用于HPV诊断； vi. 包含在细胞样品中的细胞是上皮细胞； vii. 包含在样品中的细胞是子宫颈细胞； viii. 所述细胞样品是收集于选自SUREPATH?和PRESERVCYT?的液基细胞学 介质中的子宫颈样品；和/或 ix. 所述方法是用于确定收集于液基细胞学介质中子宫颈样品中HPV核酸，优选高风 险HPV核酸的存在或不存在的自动化方法。
20. -种用于权利要求1-19中一个或多个所述方法的试剂盒，包括： a) 磁性颗粒，其中，所述磁性颗粒的表面含有阴离子交换部分； b) 变性剂，其是含有碱（优选NaOH或KOH)的碱性溶液，优选浓度范围是1.ON-2. 0N; 和 c) 含有离液剂和任选地，选自螯合剂、缓冲剂和防腐剂中一种或多种添加剂的组合物。
21. 如权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有多个槽的药盒，其 中 a) 所述药盒的第一槽包含磁性颗粒，其中，所述磁性颗粒的表面包含阴离子交换部 分； b) 所述药盒的第二槽包含变性剂，其是含有碱（优选NaOH或K0H)的碱性溶液，优选浓 度为 1.ON-2. 0N;和 c) 所述药盒的第三槽包含含有离液剂和任选地，选自螯合剂、缓冲剂和防腐剂中一种 或多种添加剂的组合物， 其中任选地，所述药盒是密封的。
22. 如权利要求20或21所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性颗粒具有一种或多种以 下特征： i) 所述磁性颗粒用聚乙烯亚胺作为阴离子交换部分作官能化； ii) 所述磁性颗粒包含在颗粒悬浮液中，所述颗粒悬浮液的pH值选自：7. 5或更低、7 或更低和6. 5或更低；和/或 iii) 所述磁性颗粒包含在颗粒悬浮液中，其中所述颗粒包含在所述悬浮液中的浓度选 自：5mg/ml-50mg/ml、10mg/ml-20mg/ml和 12. 5mg/ml_17. 5mg/ml〇
23. 如权利要求20-22中一个或多个所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具有一种 或多种以下特征： a) 该试剂盒包含含有多个孔的洗脱板； b) 该试剂盒包括至少一种适合与靶核酸杂交的探针，其中所述探针优选RNA探针； c) 该试剂盒包括能够结合双链核酸杂交体的至少一种结合剂，其中所述结合剂优选连 接于固体支持物； d) 该试剂盒包括一种或多种洗涤缓冲液； e) 该试剂盒包括至少一种含有可检测标记物，优选碱性磷酸酶的另一结合剂； f) 该试剂盒包括一种或多种检测试剂； 和/或 g) 该试剂盒包括至少一种适合与HPV祀核酸杂交的探针。
【专利摘要】确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：a)将含有阴离子交换部分的表面与样品在适合诱导所述细胞和表面之间结合的条件下接触；b)将结合有细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞；c)从细胞释放核酸；d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间形成杂交体；和e)检测所述杂交体的存在或不存在。本发明提供快速和可自动化的方法，其中通过与阴离子交换表面的结合从周围的液体介质，如液基细胞学介质细胞收集细胞，如源自子宫颈拭子样品的上皮细胞。细胞以高亲和力和快速动力学特征直接结合于优选由携带阴离子交换部分的磁性颗粒提供的阴离子交换表面。结合于阴离子交换表面的细胞易与周围介质分离，可以直接重悬于适合在步骤d)中进行的后续杂交体捕获测定的组合物以检测，例如病原体核酸，如HPV核酸。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-10
【公开号】CN104583423
【申请号】CN201380045609
【发明人】M·斯普林格-豪瑟斯, C·库普弗, P·沙茨
【申请人】凯杰有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年8月16日
【公告号】EP2890809A1, US20150218653, WO2014032990A1