。
[0031]实施例2
[0032]I)培养基制备
[0033]①菌种活化培养基(wt% ):魔芋精粉0.6%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.6%，NaCl0.6%，琼脂 2.0%, pH 自然，自来水 100mL，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0034]②菌种低温驯化培养基(wt % ):魔芋精粉0.6%, NaNO30.5%, MgSO4.7Η20 0.4%,KCl 0.5%, K2HPO40.2 %, FeSO4.7Η20 0.003%，琼脂 2.0，自来水 100mL，pH 6.5，于 0.1MPa,115 °C蒸汽灭菌15min ；
[0035]③液体种子培养基(wt % ):魔芋精粉0.6%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.6%，NaNO30.5 %, MgSO4.7H20 0.4%, KCl 0.3%, K2HPO40.2%, FeSO4.7H20 0.003%，自来水10OmT,, pH 6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0036]④液体发酵培养基(wt%):魔芋精粉 2.0%, NaNO30.5%，MgSO4.7H20 0.4%, KCl
0.5%, K2HPO40.2%, FeSO4.7H20 0.003%,自来水 100mL，ρΗ6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌15min ；
[0037]2)将产生葡甘聚糖酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
[0038]3)活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30°C — 28°C — 26°C — 24°C，驯化8天左右，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温环境中稳定生长即驯化结束；
[0039]4)按常规方法将低温驯化后的葡甘聚糖酶产生菌在液体种子培养基中于26?28°C培养48?72h，按5vt%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子;
[0040]5)将4)制备的二级种子按发酵液体积5?7%的接种量接入50L的液体发酵培养基中，在26?28°C培养96?120h时，即海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶结束；
[0041]6)将5)的发酵液在4，000?8，OOOrpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液；粗酶液活性可以达到3587U/mL ；
[0042]7)根据不同需要和使用对象不同，将6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡甘聚糖酶制剂。
[0043]实施例3
[0044]I)培养基制备
[0045]①菌种活化培养基(wt%):魔芋精粉1.0%，酵母膏0.9%，蛋白胨1.0%，NaCl
0.7%，琼脂 2.0%, pH 自然，自来水 100mL，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0046]②菌种低温驯化培养基(wt % ):魔芋精粉1.0%，NaNO30.7 %，MgSO4.7H200.5 %，KCl 0.5%, K2HPO40.3 %, FeSO4.7H20 0.004%，琼脂 2.0，自来水 100mL，pH 6.0，于 0.1MPa,115 °C蒸汽灭菌15min ；
[0047]③液体种子培养基(wt % ):魔芋精粉1.0%，酵母膏0.9%，蛋白胨1.0%，NaNO30.7 %, MgSO4.7H20 0.5%, KCl 0.5%, K2HPO40.3%, FeSO4.7H20 0.004%，自来水10OmT,, pH 6.0，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0048]④液体发酵培养基(wt% ):魔芋精粉 4.0 %，NaNO30.7 %，MgSO4.7H20 0.5%, KCl
0.5%, K2HPO40.3%, FeSO4.7H20 0.004%,自来水 10mL, pH 6.0，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0049]2)将产生葡甘聚糖酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
[0050]3)活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30°C — 28°C — 26°C — 24°C，驯化8天左右，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温环境中稳定生长即驯化结束；
[0051]4)按常规方法将低温驯化后的葡甘聚糖酶产生菌在液体种子培养基中于28?30°C培养48?72h，按5vt%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子;
[0052]5)将4)制备的二级种子按发酵液体积7?9%的接种量接入500L的液体发酵培养基中，在28?30°C培养72?96h时，即微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶结束；
[0053]6)将5)的发酵液在4，000?8，OOOrpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液；粗酶液活性可以达到3499U/mL ；
[0054]7)根据不同需要和使用对象不同，将6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡甘聚糖酶制剂。
【主权项】
1.一种海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法，其特征在于，具体包括以下步骤: (1)将能产生葡甘聚糖酶的菌种活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30 °C — 28 °C — 26 °C — 24 °C，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?1.0%，NaNO30.2 ?0.7 %，MgSO4.7H20 0.3 ?0.5 %，KCl 0.3 ?0.5 %，K2HPO40.1 ?0.3 %，FeSO4.7Η200.001 ?0.004%，琼脂 1.8 ?2.0 %，自来水 10mL, pH 值为 6.0 ?6.5，于0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ； 所述的能产生葡甘聚糖酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号:1.2244 或 1.504 或 1.775 或 5.809 ； (2)按常规方法将步骤(I)中低温驯化后的葡甘聚糖酶产生菌在液体种子培养基上于24?30°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?1.0%，酵母膏0.4?0.9%，蛋白胨0.3?1.0%，NaNO30.2 ?0.7 %，MgSO4.7H20 0.3 ?0.5 %，KCl 0.3 ?0.5 %，K2HPO40.1 ?0.3 %，FeSO4.7H20 0.001 ?0.004%,自来水 10mL, pH 值为 6.0 ?6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ； (3)将液体二级种子按发酵液体积的3?9%接种量接入液体发酵培养基中，在24?30°C培养72?144h时，即海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶结束；所述的液体发酵培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?4.0%, NaNO30.2?0.7%, MgSO4.7H20 0.3?0.5%,KCl 0.3 ?0.5% ,K2HPO40.1 ?0.3%，FeS04.7Η20 0.001 ?0.004%，自来水 100mL，pH 值为 6.0 ?6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ； (4)将步骤(3)的发酵液在4，000?8，OOOrpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液； (5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求1所述海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法，其特征在于，步骤(I)产生葡甘聚糖酶菌种的活化培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?1.0%，酵母膏0.4?0.9%，蛋白胨0.3?1.0%，NaCl 0.3?0.7%，琼脂1.8?2.0%，自来水lOOmL，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min。
【专利摘要】本发明涉及海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法，具体为将产生葡甘聚糖酶菌种活化，再经逐级低温驯化，使菌种在低温环境中生长良好，将低温驯化后的葡甘聚糖酶产生菌在24～30℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接种于液体发酵培养基中，在24～30℃培养72～144h时，得低温葡甘聚糖酶，收集到的粗酶液根据不同需要和使用对象不同，进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明生产的低温葡甘聚糖酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，缩短加工时间，简化生产工艺，降低生产成本，提高生产效率，改善并提高产品质量；该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、具有更广阔的工业开发价值与市场应用优势。
【IPC分类】C12N9-42
【公开号】CN104630188
【申请号】CN201510084703
【发明人】王晓辉, 李晓艳, 窦少华, 于爽, 张庆芳, 迟乃玉, 王强, 张旭姣, 金连豆
【申请人】大连大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月16日