照模板:0.lumol/L DNA模板
(4)HDA 等温扩增液 II:0.15mg/ml BSA，20mmol/L 乙酸镁，5.5mmol/LATP，0.02U/μ LExo-Klenow, 2ng/ μ L UvrD 解旋酶，1ng/ μ L MutL, 0.1 ug/ μ L T4gp32，dH20，pH 7.5。
[0020]本发明提供的利用上述试剂盒检测刺足根螨的方法，包括下列步骤:
(1)待检螨虫或刺足根螨DNA的提取:
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/ OD28tl在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/ μ L范围内；
(2)模板预处理:
将装有23 μ L模板预处理反应液I和I ’的反应管分别加入2 μ L待检模板，阴性对照加入2 μ L dH20，于95 °C水浴5 min后迅速放入37°C的水浴中冷却5min ；
(3)HDA等温扩增:
将上述经过处理的模板预处理混合溶液25 μ L分别加入25 μ L溶液II中，64°C加热100min，80°C lOmin，降温至 4°C ；
(4)核酸凝胶电泳检测:
核酸扩增完成后，核酸扩增完成后，在反应管中加入6 X Loading buffer (组分:30mMEDTA ；36%(v/v) Glycerol ；0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF ；0.05%(w/v) BromophenolBlue)，取产物10 μ L加入2%的琼脂糖凝胶板的样品孔中，10v电压，电泳30-40分钟，电泳成像系统拍照。如果I和I’反应液均出现10bp单条条带，可以判断为阳性，否则为阴性。
[0021 ] 下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
[0022]实施例1
利用刺足根螨HDA等温扩增检测试剂盒，检测刺足根螨:
(I)待检螨虫和刺足根螨DNA的提取(2 )模板预处理(3 ) HDA等温扩增(4)核酸凝胶电泳检测。结果如图1所示。刺足根螨样品扩增条带单一、清晰。
[0023]实施例2特异性实验
利用刺足根螨HDA等温扩增检测试剂盒，检测刺足根螨:
(1)待检螨虫和刺足根螨DNA的提取:分别提取刺足根螨R.罗宾根螨R.、长毛根螨TP.紫草根螨TP.水芋根螨TP.样品DNA，提取的
DNA OD260/ OD280在 1.6-2.0 范围内，浓度在 10-100 ng/ μ L 范围内;
(2)模板预处理:将装有23μ L模板预处理反应液I和I ’的反应管加入2 μ L待检模板(分别为刺足根螨、罗宾根螨、长毛根螨、紫草根螨、水芋根螨及dH20)于95 °C水浴5 min后迅速放入37°C的水浴中冷却5min ；
(3)HDA等温扩增:将上述经过处理的模板预处理混合溶液25μ L分别加入25 μ L溶液II 中，64°C加热 100min，80°C lOmin，降温至 4°C ；
(4)核酸凝胶电泳检测。结果如图2所示。刺足根螨样品在反应液I和I ’扩增条带单一、清晰，其他四种根螨反应液I和I ’都没有扩增，说明本试剂盒的特异性较好。
[0024]以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增快速检测引物，其特征在于， CUPl上游引物序列为SEQ ID NO I ； CNPl下游引物序列为SEQ ID NO 2 ； SUP2上游引物序列为SEQ ID NO 3 ； SNP2下游引物序列为SEQ ID NO 4。
2.一种刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括: (1)模板预处理反应液1: 0.lumol/L特异性上下游引物CUPl和CNP1，0.lmmol/LTris-HCl，0.lmmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP，dH20，pH 7.5 ； (2)模板预处理反应液I’: 0.lumol/L特异性上下游引物SUP2和SNP2，0.lmmol/LTris-HCl，0.lmmol/L DTT，0.25 mmol/L dNTP, dH20，pH 7.5 ； (3)阳性对照模板:0.lumol/L DNA模板；(4)HDA 等温扩增液 II:0.15mg/ml BSA，20mmol/L 乙酸镁，5.5mmol/LATP，0.02U/μ LExo-Klenow, 2ng/ μ L UvrD 解旋酶，1ng/ μ L MutL, 0.1 ug/ μ L T4gp32，dH20，pH 7.5 ； 其中所述的: CUPl引物序列为SEQ ID NO I ； CNPl引物序列为SEQ ID NO 2 ； SUP2引物序列为SEQ ID NO 3 ； SNP2引物序列为SEQ ID NO 4。
3.一种利用权利要求2所述试剂盒检测刺足根螨的方法，其特征在于包括下列步骤: (1)待检螨虫或刺足根螨DNA的提取: 提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/ OD28tl在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/ μ L范围内； (2)模板预处理: 将装有23 μ L模板预处理反应液I和I ’的反应管分别加入2 μ L待检模板DNA于95°C水浴5 min后迅速放入37°C的水浴中冷却5min ； (3)HDA等温扩增: 将上述经过处理的模板预处理混合溶液I和I ’ 25 μ L各加入25 μ L扩增液II，64°C加热 10min, 80°C lOmin，降温至 4°C ； (4)核酸凝胶电泳检测: 核酸扩增完成后，扩增结果在琼脂糖凝胶电泳检测，如果I和I’反应液均出现10bp单条条带，可以判断为阳性，否则为阴性。
【专利摘要】本发明公开了一种刺足根螨依赖解旋酶DNA等温扩增快速检测引物、试剂盒、检测方法。CUP1上游引物序列为SEQ ID NO 1；CNP1下游引物序列为SEQ ID NO 2；SUP2上游引物序列为SEQ ID NO 3；SNP2下游引物序列为SEQ ID NO 4。试剂盒内有反应液I、反应液I’和反应液Ⅱ。检测刺足根螨的方法包括刺足根螨DNA的提取、模板预处理、HDA等温扩增、核酸检测。本发明的优点是简单、快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104726451
【申请号】CN201510181293
【发明人】魏晓棠, 尼秀媚, 厉艳, 林超
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月16日