供体免疫结合剂的重链 CDR1、CDR2 和CDR3 和轻链CDR1、CDR2 和CDR3。
[0052] 如本领域中所知，许多兔VH链相对于鼠类和人类对应物而言具有额外配对的半 胱氨酸。除了在cys22与cys92之间形成的保守二硫桥以外，在某些兔链中，在⑶RH1的最 后一个残基与⑶RH2的第一个残基之间也形成cyS21-cyS79桥以及⑶R间的S-S桥。除 此之外，在CDR-L3中常见半胱氨酸残基对。此外，许多兔抗体CDR不属于任何先前已知的 规范结构。尤其是CDR-L3常比人类或鼠类对应物的CDR-L3更长。
[0053] 如前文所述，将非人CDR移植到本文公开的框架上产生一种分子，其中CDR以适当 的构象呈现。如果需要，可以通过移植非人供体免疫结合剂的抗原相互作用框架残基来改 善免疫结合剂的亲和力。这些位置例如可通过以下方法来鉴定
[0054] (i)鉴定各自的种系祖细胞序列或，或者在高度同源框架序列的情况下通过使用 共有序列；
[0055] (ii)产生供体可变结构域序列与步骤（i)的种系祖细胞序列或共有序列的序列 比对；和
[0056] (iii)鉴定不同的残基。
[0057] 分子表面上的不同残基在许多情况下在体内亲和力产生过程期间突变，假定产生 对抗原的亲和力。
[0058] 在另一方面，本发明提供一种包含本文所述的免疫结合剂受体框架的免疫结合 剂。所述免疫结合剂例如可以是scFv抗体、全长免疫球蛋白、Fab片段、Dab或纳米抗体。
[0059] 在一个优选的实施方案中，免疫结合剂与一个或多个分子连接，例如治疗剂（诸 如细胞毒性剂、细胞因子、趋化因子、生长因子或其它信号转导分子）、显像剂或第二蛋白 (诸如转录激活剂或DNA结合结构域）。
[0060] 如本文所公开的免疫结合剂例如可用于诊断应用、治疗应用、靶标确认或基因治 疗。
[0061] 本发明还提供一种分离的核酸，其编码本文所公开的免疫结合剂受体框架或如本 文所公开的免疫结合剂。
[0062] 在另一个实施方案中，提供一种包含本文所公开的核酸的载体。
[0063] 如本文所公开的核酸或载体例如可用于基因治疗中。
[0064] 本发明还涵盖一种包含本文所公开的载体和/或核酸的宿主细胞。
[0065] 此外，提供一种组合物，其包含如本文所公开的免疫结合剂受体框架、如本文所公 开的免疫结合剂、如本文所公开的分离的核酸或如本文所公开的载体。
[0066] 本文所公开的序列如下（X残基是⑶R插入位点且含有至少3个且至多50个氨基 酸）：
[0067]SEQIDNO. 1:可变重链框架a72
[0068]EVQLVESGPGLVKPSQTLSLTCGVS(X)n= 3-5〇WIRQHPVKGLEffIG(X)n=3_5〇RLTISVDTSKTQVSLN LRSVTAADTAVYYCAR(X)n=3_50WGQGTTVTVSS
[0069]SEQIDNO. 2:可变轻链框架KI27
[0070]EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n= 3_50WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=3_50GVPSRFSGSGSGAEF TLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3_50FGQGTKKTVLG
[0071]SEQIDNO. 3:框架序列
[0072]EIVMTQSPSTLSASV⑶RVIITC(X)n =3_5(lWYQQKPGKAPKLLIY(X)n =3_5(iGVPSRFSGSGSG AEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3_50FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGPGLVKPSQ TLSLTCGVS(X)n=3_50ffIRQHPVKGLEWIG(X)n= 3_50RLTISVDTSKTQVSLNLRSVTAADTAVYYCAR(X)n= 3_50WGQGTTVTVSS
[0073]SEQIDNO:4:接头
[0074] GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
[0075] 在另一方面，本发明提供通过将非人供体抗体的CDR移植到稳定且可溶性的抗体 框架上来使非人抗体人源化的方法。在一个尤其优选的实施方案中，源自兔抗体的CDR和 框架是上文所述的那些。
[0076] 将CDR移植到人受体框架中的通用方法已由Winter在美国专利No. 5, 225, 539中 且由Queen等人在W09007861A1中公开，它们以全文引用的方式并入本文中。用于将来自 兔单克隆抗体的CDR移植到选定框架上的通用策略与Winter等人和Queen等人的策略相 关，但在某些重要方面不同。具体来说，本发明的方法与本领域中已知的典型的Winter和 Queen方法的区别在于如本文所公开的人抗体框架尤其适合作为人或非人供体抗体的受 体。因此，与Winter和Queen的通用方法不同，用于本发明的人源化方法的框架序列不必是 与供体CDR所源自的非人（例如，兔）抗体的序列展示最大的序列类似性的框架序列。另 外，不需要从供体序列移植的框架残基来支撑CDR构象。最多可引入位于框架中的抗原结 合氨基酸或在体细胞超变期间发生的其它突变。
[0077] 下文描述用以产生具有高度溶解性和稳定性的源自人源化兔的抗体的移植方法 的具体详情。
[0078] 在本发明方法的示例性实施方案中，首先鉴定CDR供体抗体的氨基酸序列并使用 常规的序列比对工具（例如，Needleman-Wunsch算法和Blossum矩阵）比对序列。缺口的 引入和残基位置的命名可使用常规的抗体编号系统来进行。举例来说，可使用用于免疫球 蛋白可变结构域的AHo编号系统。也可以应用Kabat编号方案，因为它是用于对抗体中的 残基进行编号的最广泛采用的标准。Kabat编号例如可以使用SUBIM程序来指定。此程序 分析抗体序列的可变区并根据Kabat和合作者建立的系统来对序列进行编号（Deret等人， 1995)。框架和CDR区的定义通常是根据基于序列变异性的Kabat定义来进行且最常用。然 而，对于CDR-H1而言，名称优选是Kabat定义（通过分析3D复合结构子集的抗体与抗原之 间的接触所产生的平均接触数据）（MacCallum等人，1996)和Chotia定义（基于结构环区 的位置）的组合（也参考图1)。在A.Honegger,J.Mol.Biol. 309(2001)657-670中提供用于 鉴定抗体重链和轻链可变区中的氨基酸残基位置的两种不同编号系统的转换表。Kabat编 号系统在Kabat等人（Kabat,E.A.等人，（1991)SequencesofProteinsofImmunological Interest,第5版，美国卫生和人类服务部，NIH公布No. 91-3242)中进一步描述。AHo编 号系统在Honegger，A.*Pluckthun，A. (2001)J.Mol.Biol. 309:657-670)中进一步描述。
[0079] 兔单克隆抗体的可变结构域例如可使用例如EXCEL实施序列分析算法和基于分 析全套人抗体库的分类方法而分类为相应的人类亚群（Knappik等人，2000,JMolBiol. 2 月 11 日；296(1) : 57-86).
[0080]CDR构象可指定为供体抗原结合区，接着也可以鉴定需要保持不同规范结构的残 基位置。使用Chothia(1989)定义来确定兔抗体的六个抗体高变区中的五个（Ll、L2、L3、 H1和H2)的⑶R规范结构。
[0081] 本发明的抗体可进一步优化以展示增强的功能特性，例如增强的溶解性和/或 稳定性。在某些实施方案中，根据在2008年3月12日提交的标题为"SequenceBased EngineeringandOptimizationofSingleChainAntibodies"的PCT串请序列No.PCT/ EP2008/001958 (其以引用的方式并入本文）中所公开的"功能共有"方法来优化本发明的 抗体。
[0082]在 2008 年 6 月 25 日提交的标题为"MethodsofModifyingAntibodies,and ModifiedAntibodieswithImprovedFunctionalProperties" 的PCT申请No.PCT/ CH2008/000285 和 2008 年 6 月 25 日提交的标题为"SequenceBasedEngineeringand OptimizationofSingleChainAntibodies" 的PCT申请No.PCT/CH2008/000284 中描述 示例性的框架残基取代位置和示例性的框架取代。
[0083] 在其它实施方案中，本发明的免疫结合剂包含在2008年6月25日提交的标题为 "SolubilityOptimizationofImmunobinders"的美国临时申请序列No. 61/075, 692 中所 述的一种或多种稳定性增强突变。在某些优选的实施方案中，免疫结合剂在选自由12、103 和144 (AHo编号惯例）组成的重链氨基酸位置的氨基酸位置处包含溶解度增强突变。在一 个优选的实施方案中，免疫结合剂包含一种或多种选自以下的取代：(a)重链氨基酸位置 12处的丝氨酸（S) ;(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸（S)或苏氨酸（T);和（c)重链氨 基酸位置144处的丝氨酸（S)或苏氨酸（T)。在另一个实施方案中，免疫结合剂包含以下取 代：（a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸（S) ; (b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸（S)或苏 氨酸（T);和（c)重链氨基酸位置144处的丝氨酸⑶或苏氨酸（T)。
[0084] 在某些优选的实施方案中，免疫结合剂在根据AHo编号系统的轻链可变区的位置 1、3、4、10、47、57、91和103中的至少一者中，包含位于轻链受体框架的框架残基处的稳定 性增强突变。在一个优选的实施方案中，轻链受体框架包含一种或多种选自以下的取代： (a)位置1处的谷氨酸（E)、(b)位置3处的缬氨酸（V)、（c)位置4处的亮氨酸（L);(d)位 置10处的丝氨酸⑶；（e)位置47处的精氨酸（R) ; (e)位置57处的丝氨酸⑶；(f)位置 91处的苯丙氨酸（F);和（g)位置103处的缬氨酸（V)。
[0085] 可以使用各种可用方法的任一种来产生包含如上文所述的突变的人源化抗体。
[0086] 因此，本发明提供一种根据本文所述的方法人源化的免疫结合剂。
[0087] 在某些优选的实施方案中，所述免疫结合剂的靶标抗原是VEGF或TNFa。
[0088] 本发明所述或通过本发明的方法产生的多肽例如可使用本领域中已知的技术来 合成。或者，可合成编码所需可变区的核酸分子并通过重组方法产生多肽。
[0089] 举例来说，一旦决定人源化可变区的序列，就可以通过分子生物学领域中熟知的 技术来制造可变区或包含它的多肽。更具体来说，可使用重组DNA技术，通过用核酸序列 (例如，编码所需可变区的DNA序列（例如，经过修饰的重链或轻链；其可变结构域或其其 它抗原结合片段））转化宿主细胞来产生各种多肽。
[0090] 在一个实施方案中，可制备表达载体，其包括与至少编码乂11或Vd勺DNA序列可操 作性连接的启动子。如果必要或需要，可制备第二表达载体，其包括与编码互补可变结构域 的DNA序列可操作性连接的启动子（即，其中亲本表达载体编码VH、第二表达载体编码'，