苷酸的片 段，将其与线性化的pAd-VP3连接，构建穿梭载体pAd-Apoptin-PolyA-hTERTp-El，命名为 PAd-ATV0
[0042] 实施例2重组溶瘤腺病毒的制备
[0043] 1、共转染
[0044] 质粒pAd-ATV用Nhe I进行酶切线性化，方法如下：将适量质粒DNA与适量水混 勾，同时加入4U限制性内切酶Nhe I及10 μ 1相应的10X限制性内切酶反应缓冲液，使其 总体积为100 μ 1，轻弹管壁混匀并离心，置37°C水浴过夜。
[0045] 将IOOyl饱和酚加入线性化的质粒中，适度振荡，于4°C、12000rpm条件下离心 IOmin ;取上清，加入100 μ 1饱和酷/氯仿/异戊醇（25:24:1)，适度振荡，于4°C、12000rpm 条件下离心10min ;取上清，加入100 μ 1氯仿/异戊醇（24:1)，适度振荡，于4°C、12000rpm 条件下离心10min ;取上清，加入200 μ 1无水乙醇和20 μ 1醋酸钠，-20°C放置30min，于 4°C、12000rpm条件下离心10min ;弃上清，加入200 μ 170%乙醇洗涤沉淀一次；室温干燥后 加入50 μ 1无菌TE(10mMTris，0.1 mM EDTA，pH8. 0)溶解沉淀。将人5型腺病毒基因组与线 性化的pAd-ATV共转染HEK-293细胞。
[0046] 2、细胞内同源重组
[0047] 转染后的HEK-293细胞继续培养7~14d，每48~72h更换培养液（视细胞状态 确定）。在该继续培养的7~14d期间，若细胞出现病变既重悬细胞，收集于1.5ml离心管 内，并于-80°C /37°C反复冻融3次，冻存备用。
[0048] 若细胞在此期间未出现病变，用IOml完全培养液重悬细胞，并置IOcm细胞培养皿 内继续培养7~14d，此期间若出现病变则按上法操作，若未出现病变则需重复转染操作。
[0049] 3、重组溶瘤腺病毒的筛选
[0050] 按上法制备单层HEK-293细胞，至细胞长至80 %融合时弃去培养液，用Hank's液 洗两次。取上述重组病毒原液500 μ 1接种于6孔板的HEK-293细胞，置37°C、5% CO2细胞 培养箱内作用4h，补加 DMEM完全培养液至3ml，继续培养至出现病变。刮取独立病变处细 胞，并置于500 μ 1无血清、无抗生素的DMEM培养液中，按上法冻融3次备用。
[0051] 4、重组腺病毒的扩增及制备
[0052] 于24孔细胞培养板制备单层HEK-293细胞，至细胞长至80 %融合时弃去培养液， 用Hank's液洗两次。取单克隆重组腺病毒300 μ 1接种于24孔板的HEK-293细胞，置37°C、 5% CO2细胞培养箱内作用4h，补加 DMEM完全培养液至3ml，继续培养至出现病变。重悬病 变细胞并冻融3次，接种于25ml细胞培养瓶内的HEK-293细胞，置37°C、5% 0)2细胞培养 箱内作用4h，补加 DMEM完全培养液至3ml，继续培养至出现病变。重悬病变细胞并冻融3 次，置-80°C冻存备用，即得重组溶瘤腺病毒ATV。
[0053] 5、重组腺病毒的毒价测定
[0054] 于96孔细胞培养板制备单层HEK-293细胞，至细胞长至80 %融合时弃去培养液， 用Hank's液洗两次。取制备的单克隆重组病毒以Hank's液进行IO3~10 14稀释，取30 μ I 接种于96孔板的HEK-293细胞，置37°C、5% CO2细胞培养箱内作用4h，补加 DMEM完全培 养液至200 μ 1，继续培养72~96h。吸弃培养液，补加含1 %甲基纤维素和2%小牛血清 (FCS)的DMEM作为维持液，37°C、5% CO2培养箱中继续培养24~48h。吸弃培养液，用PBS 洗涤2次，室温下1 %甲醛固定15min，蒸馏水冲洗后用0. 1 %结晶紫染色5min，蒸馏水冲洗 后在倒置显微镜下统计病毒空斑数，按如下公式计算出每毫升病毒液中所含的空斑形成单 位（Plaque forming units, PFU)：
[0055] PFU =(病毒空斑数X稀释倍数）/接种体积
[0056] 成功构建了抗肿瘤双特异重组溶瘤腺病毒ATV，应用RT-PCR、Western blot和IFA 等方法，分别对以上重组腺病毒进行了鉴定，证明重组腺病毒所携带外源基因能够有效转 录并表达。通过连续传代的方法，对上述重组腺病毒的稳定性进行鉴定。结果表明，本发明 所构建的重组溶瘤腺病毒具有良好稳定性，且病毒毒价可维持在IO 7~10 8的水平。
[0057] 实施例3重组溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的杀伤作用（MTT实验）
[0058] 消化处于对数生长期的人肺癌细胞A549。计数并用完全细胞培养液调整细胞浓度 至5 X IO4个/ml，按100 μ 1/孔接种于96孔细胞培养板（即5 X 10 3个/孔），待细胞贴壁 后（24h左右），吸弃培养液，用Hank's液洗涤2次。用无血清无抗生素的RPMI-1640培养 液调整ATV滴度至IX 107PFU/ml、IX 106PFU/ml和IX 105PFU/ml。取实施例2制备的病毒 稀释液50 μ I ( 即IOOmoiUOmoi和Imoi)，加入经Hank' s液洗涤的培养于96孔细胞培养 板的肿瘤细胞相应孔内，于37°C、5% CO2细胞培养箱内作用4h，补加完全RPMI-1640培养 液至200 μ 1/孔。以未做任何处理的细胞作为对照。
[0059] 分别于感染24h、48h、72h和96h，于每孔加入MTT溶液（5mg/ml，溶于PBS中， 0. 22 μ m滤器过滤除菌）20 μ 1，于37°C、5% CO2细胞培养箱内作用4h，小心吸弃孔内原培 养上清液。每孔加入150 μ I DMS0,于37°C条件下放置IOmin (使结晶物充分溶解），取溶解 有紫色结晶有DMSO 135 μ 1，置96孔酶标板中，于490nm处酶联免疫检测仪上测各孔A值。 按以下公式计算杀伤率：
[0060] 杀伤率（％ )=(对照孔A值-实验孔A值）/对照孔A值
[0061] 每种处理均设3个重复孔（η = 3)，所得数据进行统计学分析。
[0062] 以未突变VP3和hTERTp的重组腺病毒Ad-VT和未插入表达盒的腺病毒Ad-mock 做为对照，操作方法同ATV。
[0063] 结果如图1和图2所示，实验表明，本发明获得的重组溶瘤腺病毒ATV在24小时 内对人肺癌细胞产生抑制作用，且其作用随作用浓度增加和作用时间延长而加强，至72小 时后可实现完全抑制，可作为肿瘤基因治疗的药物，应用前景广阔，其对肿瘤细胞的抑制作 用明显优于未突变的重组腺病毒Ad-VT。
[0064] 实施例4重组溶瘤腺病毒的体内抑瘤作用研宄
[0065] 取对数生长期的LLC肺癌细胞，用无血清Hanks液洗涤2遍后，调整细胞浓度为 IX IO7个/ml，右后肢皮下接种LLC肺癌细胞0. lml，即IX 10 6个肿瘤细胞。IOd后长出米 粒大小的结节，表明荷瘤成功。
[0066] 待荷瘤小鼠肿瘤生长至直径为5_左右时，随机分为5组，每组10只。分组情况 如下：第1组为生理盐水对照组；第2组为Ad-mock对照组；第3组为ATV治疗组；第4组 为Ad-VT治疗组。
[0067] 分组后既进行治疗，每10天一次，共接种三次。方法如下：用生理盐水稀释重组腺 病毒至I X 101QPFU/ml，治疗组瘤内注射100 μ 1病毒/只/次（即I X IO9PFU/只/次）；生 理盐水对照组瘤内注射100 μ 1生理盐水/只/次，末次治疗后16d处死小鼠，进行指标检 测。
[0068] 每日观察小鼠的精神状态、采食情况和存活情况。荷瘤后既开始测量肿瘤体积，每 2天一次，方法如下：游标卡尺测量肿瘤长径及短径长度（包括皮肤厚度在内）。应用下列 公式计算肿瘤体积：
[0069] 肿瘤体积（V) = A2XBXO. 52
[0070] 式中，A为肿瘤短径长度；B为肿瘤长径长度。
[0071] 根据末次测量荷瘤小鼠的肿瘤体积计算抑瘤率，计算公式如下：
[0072] 抑瘤率（％) = [(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积）/对照组肿瘤体 积]XlOO%
[0073] 结果如图3和图4所示，结果表明，本发明的重组溶瘤腺病毒ATV可显著延缓动物 模型实体肿瘤的生长，提高荷瘤动物模型生存率。另外，ATV对实体肿瘤的抑瘤作用，显著 高于Ad-VT和其它对照组。
[0074] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 重组溶瘤腺病毒，其特征在于，包括溶瘤腺病毒载体和插入其中的表达盒，所述表达 盒包括由人端粒酶逆转录酶启动子与Ela基因组成的表达盒以及由真核启动子与鸡贫血 病病毒VP3基因组成的表达盒； 其中，所述鸡贫血病病毒VP3基因的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示，所述人端粒酶逆 转录酶启动子的核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。2. 根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒，其特征在于，所述真核启动子为人类巨细 胞病毒启动子。3. 根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒，其特征在于，所述溶瘤腺病毒载体源自人5 型腺病毒。4. 根据权利要求3所述的重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其由溶瘤腺病毒载体、人端粒 酶逆转录酶启动子、Ela基因、人类巨细胞病毒启动子、鸡贫血病病毒VP3基因和多聚腺苷 酸序列组成。5. 根据权利要求4所述的重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其序列如Seq ID No. 3所示。6. 权利要求1-5任一项所述重组溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物和预防术后肿瘤复发 药物中的应用。7. 由权利要求1-5任一项所述重组溶瘤腺病毒制备的抗肿瘤药物和预防术后肿瘤复 发药物。8. 根据权利要求7所述的药物，其为注射剂、喷雾剂或涂抹剂。
【专利摘要】本发明提供一种新型的重组溶瘤腺病毒及应用。所述重组溶瘤腺病毒具有肿瘤特异性复制和肿瘤特异性杀伤的双重特异性，可以在肿瘤细胞内特异性复制，同时表达对肿瘤细胞具有特异性杀伤能力的凋亡素基因，从而通过增强肿瘤特异性提高其安全性。同时，通过重组溶瘤腺病毒的复制和凋亡素基因本身的杀伤能力，提高其肿瘤杀伤能力。
【IPC分类】A61P35/00, A61K35/761, C12N7/01
【公开号】CN104946601
【申请号】CN201510283865
【发明人】金宁一, 李霄, 鲁会军, 李昌, 田明尧
【申请人】金宁一
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月28日