种所不能替代的分 子手段。 (四）
【附图说明】
[0035] 图1为对油茶良种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；编号3为油茶良种 长林18号，扩增出了一条356bp的特异DNA条带；其余编号为其它的长林油茶良种，未见有 300bp多大小的特异DNA条带产生。 (五）
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0037] 实施例1 :
[0038] (1)油茶良种基因组DNA的提取：
[0039] 取待测油茶良种幼嫩叶片0. 03g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取利用新型快 速植物基因组DNA提取盒（DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司），提取获得油 茶良种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物通过1. 5 %的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光 光度计（Nanodrop Technologies，USA)来检测完整性、纯度及浓度。0D26(i/0D28(i>L8 的 DNA 样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20°C冰箱贮藏备用。
[0040] ⑵设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：
[0041] 上游引物：5 ' -AGCCAAAATTGCGTCAAGTCTTCT-3 '和下游引物： 5' -AGCAAGCAAAACCACACCCCCAA-3'，由上海生物工程技术有限公司合成。
[0042] (3) PCR 扩增：
[0043] PCR反应液组成：2 X Power Taq PCR Master Mix (PR1700，BioTeke，北京百泰克生 物技术有限公司）1〇 μ L，10 μ M上下游特异引物对各1 μ L，20ng/μ L模板DNA 3 μ L，CldH2O 5 μ L0
[0044] 扩增反应在Life ECO型扩增仪（Bioer，杭州博日科技有限公司）上进行。
[0045] 扩增条件：
[0046] 94°C 预变性 7min ;
[0047] 94°C变性 45min、62°C退火 45s、72°C延伸 2min，共 30 个循环；
[0048] 最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
[0049] (4)电泳检测：取步骤（3) PCR扩增产物5 yL，与I yL 0· 25 %溴酚兰缓冲液混匀， 点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含 O.Syg/mL EB的水溶液中染色30分钟，然后在美国伯乐自动凝胶图像分析仪（Chemi Doc XRS imaging system，Bi〇-Rad，Hercules，CA，USA)上照相。
[0050] 按照上述方法，分别对多个油茶良种（编号I~12代表油茶良种依次为：1 :长林3 号、2 :长林4号、3 :长林18号、4 :长林21号、5 :长林23号、6 :长林26号、7 :长林27号、8 : 长林40号、9 :长林53号、10 :长林55号、11 :长林56号、12 :长林166号）的特异引物PCR 扩增图谱进行电泳检测，结果见图1。
[0051] 图中一条约200bp左右大小的DNA条带为所有油茶良种所共有。而箭头所指为仅 从编号为3的油茶良种长林18号中扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量约为300bp多大 小的特异DNA条带，而其余编号的长林油茶良种，未见有300bp多大小的特殊DNA条带产 生，可见本发明开发出的分子特异性标记用于油茶良种长林18号的鉴别，其稳定性、特异 性非常高。
【主权项】
1. 油茶良种长林18号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下： 上游引物：5 ' -AGCCAAAATTGCGTCAAGTCTTCT-3 '， 下游引物：5' -AGCAAGCAAAACCACACCCCCAA-3'。2. -种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对油茶良种长林18号进行快速鉴 定的方法，所述方法为：提取待测油茶品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性 标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现356bp 的特异DNA条带，则待测油茶品种为油茶良种长林18号，反之则否；所述分子特异性标记引 物序列为： 上游引物：5 ' -AGCCAAAATTGCGTCAAGTCTTCT-3 '， 下游引物：5' -AGCAAGCAAAACCACACCCCCAA-3'。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：94°C预变性7min ; 94°C变性45min、62°C退火45s、72°C延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终止 温度为4°C。4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： ⑴取待测油茶叶片，加液氮磨碎，提取待测油茶叶片的基因组DNA ; (2) 以步骤⑴提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物， 进行PCR扩增： PCR反应体系每20 y L组成如下： 2. Power Taq PCR Master Mix IOuL IOyM上、下游引物 各IyL 20ng/ y L 模板 DNA 3 y L (IdH2O 补足至 20 y L ; PCR反应条件如下： 94°C预变性7min ;94°C变性45min、62°C退火45s、72°C延伸2min，共30个循环；最后于 72°C补平7min，终止温度为4°C ; (3) 取步骤（2)扩增产物5 y L，与I y L0. 25 %溴酚兰缓冲液混匀，点样于1. 5%的琼脂 糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分 析仪上照相，若电泳结果出现356bp的DNA条带，则待测油茶品种为长林18号，反之则否。
【专利摘要】本发明涉及一对特异性高的油茶良种长林18号的分子特异性标记引物，以及一种能对油茶良种长林18号进行快速鉴定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCCAAAATTGCGTCAAGTCTTCT-3′，下游引物：5′-AGCAAGCAAAACCACACCCCCAA-3′。本发明分子特异性标记引物可对油茶良种长林18号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104946640
【申请号】CN201510406377
【发明人】魏海龙, 李海波, 胡传久, 徐梁, 王丽玲
【申请人】浙江省林业科学研究院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月10日