例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0033] 含有酶切位点的OsAnthl启动子的获得
[0034] 步骤1、引物的设计
[0035] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻OsAnthl基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设计引物的酶切位点。
[0036] 本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391 (来自于CAMBIA，公开使用载体， 安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标 基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID N〇:2)5'端带Hindlll，酶切位点 (AAGCTT)，反向引物（SEQ ID No:3)5'端带EcoRI，酶切位点（GAATTC)，引物序列如下：
[0037] 正向引物：AAGCTTAAAATCCACCCATTGCCTCCAG HindIII
[0038] 反向引物：GAATTCGCACGCGAACGACGGAGGAGGA EcoRI
[0039] 由深圳华大基因公司合成。
[0040] 步骤2、启动子OsAnthl的获得
[0041 ] 以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsAnth 1，按 常规PCR体系，采用如下扩增程序：95°C预变性5min ;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延 伸2min30s，循环35次；最后72°C延伸lOmin。
[0042] 回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1753bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体 (购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue 感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌 落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和EcoRI进行双酶切验证， 如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所 要获得的启动子OsAnthl，其核酸序列如SEQ ID N〇:l所示。
[0043] 棺物表汰裁体的构律和农杆菌的转化
[0044] 从上面"启动子OsAnthl的获得"过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII 和EcoRI酶切，回收启动子OsAnthl片段。同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1391进 行线性化处理、回收PCAMBIA1391，将上述的OsAnthl片段和pCAMBIA1391片段用T4连 接酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子OsAnthl与Gus基因融合的植物表达载 体pCAMBIA1391_0sAnthl，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水 稻组保存）。
[0045] 利用启动子OsAnthl驱动Gus报告基闵在水稻中表汰
[0046] 步骤1 :农杆菌介导的水稻遗传转化
[0047] 成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有1滴TWeen20 的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4%)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯 酸钠，无菌水洗3-6遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种 子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养10-12天后将愈伤与 胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于 农杆菌的转化。
[0048] 采用上述"植物表达载体的构建和农杆菌的转化"过程中转入了重组表达载体的 根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得OsAnthl: :gUS转基因水稻植株，该遗传转 化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan (Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J]. Plant Cell Report, 2012. D0I10. 1007/s00299-01201275-3.) 等提出的方法。
[0049] 步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色
[0050] 将转化了 OsAnthl启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶、花器官分别进 行⑶S染色：将各组织分别浸于⑶S染色液中，37°C，过夜24小时，75 %乙醇脱色，将组织中 的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录GUS染色的结果。结果如图3所示，GUS基 因只在转基因水稻幼穗的花药中有强表达，显现出肉眼可明显观测到的很强的蓝色；而在 其它各器官（根、茎和叶片）中，基本没有检测到GUS基因的表达。这表明，本发明的启动 子能够在转基因植株的花药中指导其下游的GUS蛋白表达，这种表达具有花药组织表达特 异性。
[0051] 虽然本发明以水稻为例进行描述，但是申请人认为，本发明所获得启动子的应用 场景不限于水稻，本发明启动子可以用于各种单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高 梁或燕麦，优选为水稻。
[0052] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【主权项】
1. 一种水稻花药特异表达启动子OsAnthl，其特征在于，所述水稻花药特异性强表达 启动子包含 1) 序列表中SEQID NO: 1所示的DNA分子；或者 2) 在严格条件下与SEQID NO: 1中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或 者 3) 与1)或2)中所限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA 分子。2. -种水稻花药特异性强表达启动子，其特征在于，所述水稻花药特异表达启动子 OsAnthl由SEQID NO: 1所示的DNA分子构成。3. 如权利要求1或2所述的水稻花药特异表达启动子OsAnthl，其特征在于，所述水稻 花药特异表达启动子OsAnthl从水稻属植物中分离获得。4. 一组扩增权利要求1或2所述的水稻花药特异性强表达启动子OsAnthl的全部或其 任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID NO :2所述，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。5. 含有权利要求1所述水稻花药特异性强表达启动子的重组载体或表达盒，在所述重 组载体或表达盒中，权利要求1所述的水稻花药特异表达启动子OsAnthl连接于待表达基 因的上游，所述待表达基因包括具有改变水稻花药性状能力的基因。6. -种利用权利要求1中所述的水稻花药特异表达启动子OsAnthl获得相应转化子的 方法，其特征在于，所述方法包括将所述水稻花药特异性强表达启动子转入第一菌种中，利 用转入了所述水稻花药特异表达启动子OsAnthl的第一菌种和植物载体构建植物表达载 体，再将所述植物表达载体转入到受体菌中，并利用所述受体菌获得转基因植物细胞、组织 或植株。7. -种根据权利要求1中任意一项所述的水稻花药特异表达启动子OsAnthl在培育转 基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中任意一项所述的水稻 花药特异表达的启动子OsAnthl连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达 载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植 物为单子叶植物：水稻、玉米、小麦、大麦、高梁或燕麦。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物花药的生长特性。
【专利摘要】本发明提供一种花药特异表达启动子OsAnth1及其应用。本发明分离到一个可在植物花药中特异性表达的启动子。所述的启动子可指导目的基因在植物花药中特异性高表达，而在植物的其它组织中低表达或不表达。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体，以及利用该启动子获得相应宿主菌和转化子的方法。此外，本发明将其应用于植物基因工程中。该启动子对于水稻花药相关的研究具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
【IPC分类】C12N15/11, A01H5/00, C12N15/113, C12N15/82, C12N5/10
【公开号】CN104946649
【申请号】CN201510398912
【发明人】秦瑞英, 杨剑波, 李 浩, 李莉, 李娟 , 魏鹏程, 许蓉芳, 马卉, 杨亚春
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月7日