如下 操作制得：PCR扩增梅毒螺旋体17Kda(TpN17)基因（GeneBank No :M74825)的22aa~156aa 所对应的DNA区段，其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI位点且EcoRI位点之 前带有6个His氨基酸的编码序列以及终止密码TAA，PCR的片段经回收之后，用BamHI和 EcoRI酶切，连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表达载体pET-24a(Novagen公司，货号： 69864-3)中，得到重组质粒pET-24a-TP17,转化后表达得到的包被抗原记为TP018。
[0102] 上述缀合物还可以应用于制备诊断试剂领域。
[0103] 下面为具体实施例部分。
[0104] 以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等（金冬雁，黎孟楓等译）所著的的分子克 隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法 实现。所有操作均采用本领域标准操作过程，所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规 载体。
[0105] 实施例1、包被抗原重组质粒的制备
[0106] 选取梅毒螺旋体 17Kda(TpN17)基因（GeneBank 序号 M74825)的 63aa-156aa 所对 应的DNA区段，设计引物，上游引物序列如SEQ ID No. 3所示，下游引物序列如SEQ ID No. 4 所示。其上游引物带有BamHI位点，下游引物带有EcoRI位点且EcoRI位点之前带有6个 His氨基酸的编码序列以及终止密码TAA。
[0107] PCR 扩增，PCR 条件为：94°C 变性 5min ;(94°C，30s，55°C，30s，72°C，30s) X30 个 循环；最后72°C延伸lOmin。回收PCR的片段（本发明所使用的分子生物学提取和回收 试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司），之后用BamHI和EcoRI酶切（本发明所采用 的各种分子生物学用酶均购自大连宝生物工程有限公司），回收酶切产物，连接到用BamHI 和EcoRI酶切之后的表达载体pET-24a(Novagen公司，货号：69864-3)中，得到重组质粒 pET-24a-TP 17，即本发明的包被抗原的重组质粒。
[0108] 实施例2、包被抗原的表达与纯化
[0109] 将pET-24a-TP17质粒转化BL21 (DE3)感受态细胞（天根生化科技有限公司，货号 CB105)，涂布于含100 y g/mL硫酸卡那霉素（上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简 称生工，货号KB0286)的LB平板上，37°C过夜培养，挑取单克隆，用含同一浓度硫酸卡那霉 素（上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简称生工，货号KB0286)的500mL LB培养 基37°C振荡培养至0D600 = 1. 0左右，用终浓度为0. 5mM的IPTG (生工，货号IB0168) 37°C 诱导4小时。4°C，5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20ml裂解缓冲液（50mM Tirs-HCl，pH8.0，lmM EDTA，100mM NaCl)重悬，超声破碎，4°C，12000g 离心 20 分钟，经 SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分目的蛋白分布在裂解液上清中。收集上清，逐滴缓慢加入饱 和硫酸铵溶液（广东光华化学试剂公司，货号：7783-20-2,调pH7.4)至硫酸铵终浓度为 35%，4°C静置30min，4°C 12000g离心20分钟，收集上清，继续逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶 液至硫酸铵终浓度为60 %，4°C静置30min，4°C 12000g离心20分钟，收集沉淀，用5ml平衡 缓冲液（25mM Tris，200mM NaCl，25mM咪唑pH8. 0)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液 平衡Ni-NTA亲和柱（Qiagen公司，货号30210)之后，加入蛋白样，用10倍介质体积的平衡 缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5倍体积洗脱缓冲液（25mM Tris，200mM NaCl，200mM咪唑 pH8. 0)，洗脱目的蛋白，测定蛋白浓度，-20°C保存备用，pET-24a-TP17质粒表达纯化后得到 包被抗原命名为TP018。
[0110] 实施例3、融合蛋白重组质粒的制备
[0111] 选取0SMY基因（GeneBank序号NC_007779. 1)的全长⑶S，设计引物，上游引物序 列如SEQ ID No. 5所示，下游引物序列如SEQ ID No. 6所示。其上游引物带有BamHI位点， 下游引物带有EcoRI位点。
[0112] 用 PCR 扩增，PCR 条件为：PCR 条件为：94°C变性 5min ;(94°C，30s，57°C 30s，72°C， 40s) X30个循环；最后72°C延伸10min，通过AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（Axygen，货 号：AP-GX-50)回收PCR扩增的DNA产物，之后用BamHI/EcoRI酶切，得到如即SEQ ID No. 1 序列所示的DNA片段，连接到用BamHI和EcoRI双酶切处理之后的表达载体pET-26b(+) (Novagen 公司，货号：VYN0166)中，得到重组质粒 pET-26b (+)-OSMY，用 EcoRI/HindIII酶切 pET-26b (+) -0SMY重组质粒，作为大肠杆菌周质蛋白的终载体。
[0113] PCR 扩增梅毒螺旋体 17Kda(TpN17)基因（GeneBank 序号 M74825)的 63aa-156aa 所对应的DNA区段，设计引物，上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No. 8所示。上游引物带有EcoRI位点，下游引物带有HindIII位点，用PCR扩增，PCR 条件为：PCR 条件为：94°C 变性 5min ;(94°C，30s，56°C，30s，72°C，25s) X30 个循环；最 后72°C延伸lOmin，AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒（Axygen，货号：AP-GX-50)回收PCR片 段，之后用EcoRI/HindIII酶切PCR回收片段，连入酶切好的大肠杆菌周质蛋白的终载体 pET-26b (+)-0SMY中，即本发明的融合蛋白的重组质粒，以下简称pET-26b (+)-0SMY-TP17。
[0114] 实施例4、融合蛋白的表达与纯化
[0115] 将pET-26b (+) -0SMY-TP17质粒转化BL21 (DE3)感受态细胞（天根生化科技有限 公司，货号CB105)，涂布于含100 y g/mL氨苄西林钠（生工，货号A0339)的LB平板上，37°C 过夜培养，挑取单克隆，用含同一浓度的500ml LB培养基37°C振荡培养至0D600 = 1. 0左 右，用终浓度为0. 5mM的IPTG 37°C诱导4小时。4°C 5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液 的菌体用20ml裂解缓冲液（50mM Tirs-HCl，pH8. 0，lmM EDTA，100mM NaCl)重悬，超声破碎， 4°C 12000g离心20分钟，经SDS-PAGE电泳鉴定后，80%目的蛋白分布在裂解液上清中。收 集上清，逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为20%，4°C静置30min，4°C 12000g 离心20分钟，收集上清，继续逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为40%，4°C静 置30min，4°C 12000g离心20分钟，收集沉淀，用10ml平衡缓冲液（25mM Tris，200mM NaCl， 25mM咪唑pH8.0)溶解。用10倍柱床体积的平衡缓冲液平衡Ni-NTA亲和柱（Qiagen公司， 货号30210)之后，加入蛋白样，用10倍介质体积的平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，再用5 倍体积洗脱缓冲液（25mM Tris，200mM NaCl，200mM咪唑pH8. 0)，洗脱目的蛋白，测定蛋白浓 度，-20 °C保存备用，pET-26b (+)-0SMY-TP17质粒表达后得到的融合蛋白命名为TP045。
[0116]上述融合蛋白包含了梅毒螺旋体抗原和大肠杆囷周质蛋白（0SMY)，0SMY蛋白能 促进蛋白溶解性及细胞定位，而周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，明显提高目 的蛋白可溶部分比例及活性。通过梅毒螺旋体抗原与0SMY蛋白融合表达，得到的融合蛋白 可溶性增强，蛋白活性高。
[0117] 实施例5、梅毒检测试剂盒的制备
[0118] 对基因工程重组制备的包被抗原、融合蛋白，进行有条件的优化选择后，建立本发 明的双抗原夹心ELISA检测方法。
[0119] ⑴支持物的制备
[0120] 将纯化好的包被抗原（TP018抗原）用碳酸盐缓冲液（50mM，PH9. 51)稀释至1 y g/ Ml，100 y L/孔加入酶标板（深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板），4°C包被24小时，次 日用 PBST(10mM PB，150mM NaCl，0. 05% Tween-20，pH7. 4)洗涤液洗板二次，拍干，120 y L/ 孔加入含20%新生牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所），8%蔗糖，5%。酪蛋白（美国 Sigma-Aldrich 公司，货号 C-8645)，l%。巯基乙醇（生工，货号 M0482)，150mM NaCl 的pH7. 4,10mM PB封闭液，37 °C封闭2小时，甩掉孔内液体，拍干，置室温20-25 °C、湿度 55