% -65%、有通风设备的房间内风干，包被完毕。
[0121] (2)缀合物的制备
[0122] 采用NaI04氧化法。称取8mg辣根过氧化物酶（HRP，英国Biozyme laboratories 公司，货号：HRP4)溶解于0. 4ml超纯水中，再缓慢滴加0. 4mL超纯水新鲜配制的20mg/mL NaI04(生工，货号ST1244)溶液，室温下避光轻柔搅拌40分钟后，加入48yL乙二醇（取 8 y 1乙二醇溶于40 y 1蒸馏水中）溶液，室温下避光搅拌40分钟。然后立即加入lmL预先 在20mM，pH9. 51碳酸盐缓冲液中透析2小时，lmg/mL的纯化好的融合蛋白（TP045)，之后， 在4°C避光条件下，混合物在20mM，pH9. 51碳酸盐缓冲液中透析过夜。次日，向混合物中滴 加80yL新鲜配制的5mg/mL NaBH4(生工，货号ST1268)溶液，混匀，4°C静置2小时。将上 述液体装入透析袋中，在PBS缓冲液（150mM，pH7. 4)中透析，4°C过夜。加入酶保护剂及终 浓度50%的甘油混匀后，置于-20°C避光保存备用。融合蛋白标记标记物之后的缀合物在 以下的文字中称为TP045-HRP。
[0123] (3)检测
[0124] 在包被抗原包被的酶标板中先加入50 y L待测样品，以及50 y L -定比例稀释的 缀合物（TP045-HRP)，37°C反应1小时，甩掉孔内液体，用PBST洗涤液洗板五次，拍干；所使 用的显色系统为含有过氧化氢的拧橡酸盐缓冲液的显色液A和含有四甲基联苯胶（TMB)的 拧橡酸盐缓冲液的显色液B各50 y L，37°C避光显色15分钟。每孔加50 y L，含2M硫酸的 终止液终止反应，酶标仪450nm波长（参考波长630nm)空白孔校零后读取0D值。
[0125] 截值Cut of f Value (C0V)计算：C0V =阴性对照平均0D值X 2. 0 (阴性对照0D值 低于0. 075作0. 075计算，高于0. 075按实际0D值计算），待测样品0D值彡C0V为阳性，待 测样品0D值< C0V为阴性。
[0126] 实施例6、双抗原夹心法ELISA检测梅毒螺旋体抗体
[0127] 本发明的梅毒检测试剂盒，采用双抗原夹心法ELISA检测梅毒螺旋体抗体，其灵 敏度、特异性、重复性、稳定性、精密性等指标均优于现有商品化试剂盒。
[0128] (1)灵敏度：本发明的梅毒检测试剂盒可检出临检中心梅毒螺旋体（TP)ELISA灵 敏度质控品，检测临床130例经确认的梅毒螺旋体（TP)阳性血清，结果全部检出。
[0129] (2)特异性：本发明的梅毒检测试剂盒检测临床2000份确认梅毒螺旋体（TP)阴 性血清，假阳率为0. 13%，远低于市场现有TP双抗原夹心法ELISA产品的假阳率0. 5%~ 1. 5%，由此可见，本发明的试剂盒特异性好。
[0130] (3)重复性：对阴、阳性待测样品各35份，采用不同时不同批次不同操作者进行10 次检测，考查试剂盒的重复性，结果显示本发明的梅毒检测试剂盒对阴、阳性判定结果的重 复性为100%。由此可见，本发明的试剂盒的再现性好，重复性高。
[0131] (4)稳定性：将本发明制成的TP045-HRP缀合物，以及梅毒检测试剂盒分别37°C考 核7天，取出后与同时4°C存放的TP045-HRP缀合物和梅毒检测试剂盒在同一条件下检测相 同的阴、阳性质控血清，表1表示TP045-HRP缀合物稳定性实验结果，表2表示本发明梅毒 检测试剂盒的稳定性实验结果。由此可见，本发明的TP045-HRP缀合物和梅毒检测试剂盒 稳定性好。
[0132] 表1、TP045-HRP缀合物稳定性实验结果
[0133]
[0137] (5)精密性：在用本发明的梅毒检测试剂盒检测同一份已知阳性标本，多次平行 做10次重复检测，得到的结果均为阳性，由此可见，本发明的试剂盒精密性较好。
[0138] 普通的双抗原夹心法，由于标记物直接标记在抗原上面，其存在的固有缺陷是：为 了提高灵敏度，标记比例越高越好，但是比例过高会使抗原被标记物包裹，抗原表位被包埋 而导致抗原活性降低，因此，为了兼顾标记比例提高过程中抗原的活性损失造成的灵敏度 下降，标记比例无法无限制提高，造成灵敏度提高有限。
[0139] 本发明公开的缀合物包括梅毒检测抗原、辅助蛋白和标记物，辅助蛋白嵌合在梅 毒检测抗原的N端形成融合蛋白，标记物标记在辅助蛋白上，避免了标记物与抗原直接作 用。与传统的试剂相比，该缀合物随标记比例提高，抗原不会被标记物包裹，避免了抗原决 定簇与标记物结合造成的抗原活性降低，从而不会影响抗原活性，检测时可适当提高标记 物的比例，进而提高检测的灵敏度和特异性。
[0140] 特别的，当辅助蛋白为大肠杆菌周质蛋白（0SMY)时，由于0SMY亲水性较好，赖氨 酸含量较高，且分布均匀，利于HRP的标记，避免了抗原的抗原决定簇与标记物直接结合造 成的抗原活性降低，尽可能保持了抗原的活性，从而提高试剂盒的灵敏度。
[0141] 此外，本发明提供的包含上述缀合物的梅毒检测试剂盒，在免疫检测时，以"支持 物-梅毒检测抗原-待测梅毒螺旋体抗体-缀合物-可识别信号"的形式完成检测，标记物 标记在缀合物中的辅助蛋白上，避免了抗原的抗原决定簇与标记物直接结合造成的抗原活 性降低，尽可能保持了抗原的活性，从而提高试剂盒的灵敏度。该试剂盒具有灵敏度高、特 异型好、重复性好、稳定性高、精密性好的优点。
[0142] 以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详 细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发 明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种缀合物，其特征在于，包括融合蛋白和标记物，所述融合蛋白包括梅毒检测抗原 以及嵌合在所述梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，所述标记物标记在所述辅助蛋白上。2. 根据权利要求1所述的缀合物，其特征在于，所述梅毒检测抗原为梅毒螺旋体抗原。3. 根据权利要求1所述的缀合物，其特征在于，所述辅助蛋白为大肠杆菌周质蛋白。4. 根据权利要求3所述的缀合物，其特征在于，所述大肠杆菌周质蛋白包括： (a)、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽； (b)、与SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少90%同源性的多核苷 酸编码得到的多肽；或 (c) 、由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、 替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。5. 根据权利要求3所述的缀合物，其特征在于，所述大肠杆菌周质蛋白包括： (a)、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的多肽； (b)、与SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少90%同源性的多肽；或 (c)、由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替 代或增加得到的多肽。6. 根据权利要求1所述的缀合物，其特征在于，所述标记物为酶、化学发光物质、荧光 物质、放射性物质和胶体中的至少一种。7. -种权利要求1~6中任一项所述缀合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一、提供基因表达载体，所述基因表达载体用于表达融合蛋白，所述融合蛋白包括 梅毒检测抗原以及嵌合在所述梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白； 步骤二、将所述基因表达载体转化到宿主细胞中，所述宿主细胞为原核细胞； 步骤三、对转化了所述基因表达载体的所述宿主细胞进行诱导表达，分离得到表达 液； 步骤四、在所述表达液中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20%，充分静止后收集 上清，接着在所述上清中加入饱和硫酸铵至硫酸铵的终浓度为40%，充分静止后收集沉淀， 将所述沉淀重新溶解，得到粗产物； 步骤五、利用Ni-NTA亲和柱纯化所述粗产物，得到所述融合蛋白； 步骤六、对所述融合蛋白进行标记，使得标记物标记在所述辅助蛋白上，得到所述缀合 物。8. -种梅毒检测试剂，其特征在于，包括权利要求1~6中任一项所述的缀合物。9. 一种梅毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的梅毒检测试剂。10. 根据权利要求1~6中任一项所述缀合物在制备梅毒诊断试剂领域中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种缀合物，包括融合蛋白和标记物，融合蛋白包括梅毒检测抗原以及嵌合在梅毒检测抗原的N端的辅助蛋白，标记物标记在辅助蛋白上。这种缀合物中，辅助蛋白嵌合在梅毒检测抗原的N端，标记物标记在辅助蛋白上，避免了标记物与抗原直接作用。与传统的试剂相比，该缀合物随标记比例提高，抗原不会被标记物包裹，避免了抗原决定簇与标记物结合造成的抗原活性降低，从而不会影响抗原活性，检测时可适当提高标记物的比例，进而提高检测的灵敏度和特异性。本发明还公开了上述缀合物的制备方法及应用。
【IPC分类】G01N33/571, C07K1/13, G01N33/68, C07K19/00
【公开号】CN105037555
【申请号】CN201510359977
【发明人】范凌云, 孟媛, 李泓彦
【申请人】菲鹏生物股份有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月25日