端序列为：GTGCTCGAGTTACGGGITCAGCGGCGGATCTITC。
[0049] 进一步的，本发明步骤4)经NcoI与XhoI双酶切鉴定步骤为：回收目的产物的 目的条带，连接后转化DH5a，用卡那霉素LB平板筛选，挑取阳性菌落用含卡那霉素LB培养 液培养，抽提质粒，用NcoI/XhoI双酶切鉴定。
[0050] 本发明的第三个目的在于提供圆环病毒2型Cap蛋白表达载体用于检测免疫答应 效应。
[0051] 本发明所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体用于表达猪圆环病毒2型Cap 蛋白。
[0052] 本发明的第四个目的在于提供利用本发明的表达载体表达猪圆环病毒2型Cap蛋 白的方法，该方法包括以下步骤：
[0053] 1)诱导表达：将表达载体转化大肠杆菌中，用卡那霉素LB平板筛选，获得阳性菌 株，挑取阳性菌落接种含卡那霉素LB培养液，震荡培养至少12h，然后经扩大培养、震荡培 养4h后将温度降低至25~30°C，加入IPTG诱导培养，离心收集菌体加入裂解液重悬菌体， 用高压均质机破碎菌体，离心收集上清，用SDS-PAGE鉴定表达载体表达情况；
[0054] 2)猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化，按照以下步骤进行：
[0055] a)将高压均质机破碎后的菌体离心上清，使用50%饱和度硫酸铵进行分级沉淀， 离心收获沉淀；
[0056] b)用PBS缓冲液溶解，离心弃去沉淀；
[0057]c)上清加入5%曲拉通X-114,冰上混合后转移至37°C的水浴保持30分钟；
[0058] d)待溶液浑浊后，高速离心使溶液分层，小心转移水相，丢弃曲拉通有机相；
[0059] e)重复步骤c)、d)直到内毒素小于50EU/ml，SDS-PAGE确定猪圆环病毒2型Cap 蛋白浓度。
[0060] 本发明的第五个目的在于提供猪圆环病毒2型Cap蛋白在制备抗猪圆环病毒2型 Cap蛋白疫苗中的应用。
[0061] 本发明还提供了一种猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗，包括抗原和佐剂，所述抗原为 本发明所获得的猪圆环病毒2型Cap蛋白，猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原和佐剂的体积比 为4 : 1，猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原的浓度为30yg/mL-40iig/mL。
[0062] 以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中，除具体列说明的试剂和材料的来 源外，其余的材料均为本领域现有技术，可以通过购买得到。
[0063] 在下述实施例中，DH5a、pET_28a载体由镇江瑞华生物科技有限公司提供；限制 性内切酶NcoI与XhoI购自TaKaRa公司；LB培养基购自OXOID公司；BL21(DE3)菌株由镇 江瑞华生物科技有限公司提供；IPTG(异丙基硫代半乳糖苷）购自Sigma公司；丙烯酰胺、 甲叉双丙烯酰胺购自广州市齐云生物技术有限公司；其它化学试剂均为分析纯；裂解液为 20mmol/LTris缓冲液，其PH为7. 2,其中NaCl浓度为300mmol/L。小鼠购自上海医学实验 动物中心；水佐剂GelST-Ol由S印pic公司惠赠；DMEM培养液购自Gibco公司；胎牛血清 购自Hyclone公司；PCV2阳性血清购自VMRD公司；FITC标记兔抗鼠二抗购自KPL公司。
[0064] 实施例1
[0065] 猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体，通过以下方法构建而成：
[0066] 1)获取猪圆环病毒2型0RF2序列：从GeneBank序列库中获得PCV20RF2序列；
[0067] 2)对0RF2序列的进行密码子优化：根据大肠杆菌中密码子的使用频率，对0RF2 序列的密码子进行优化，以便0RF2在大肠杆菌中进行高效表达，得到优化密码子核苷酸序 列为SEQIDNO. 1所示；
[0068] 3)PCR扩增：以上述优化密码子为模板使用叠加PCR方法进行全基因扩增，扩增过 程所用的引物为SEQIDNO. 2-SEQIDNO. 3 :
[0069] 上游引物由 5' 端向 3' 端序列为：CATGCCATGGGCACCTACCCGCGCCGTCGTT(SEQID NO. 2)；
[0070] 下游引物 5'端向 3'端序列为：GTGCTCGAGTTACGGGITCAGCGGCGGATCITTC(SEQID NO. 3)；
[0071] PCR扩增结果参见图1所示，图1的结果表明序列成功合成，且大小与预期一致；
[0072]4)构建表达载体：将pET_28a用NcoI与XhoI双酶切，然后将步骤3)的扩增产 物克隆至NcoI与XhoI位点之间，回收目的条带，连接后转化DH5a，用卡那霉素LB平板 筛选，挑取阳性菌落用含卡那霉素LB培养液培养，抽提质粒，用NcoI与XhoI双酶切鉴 定，测序正确，表达载体构建完成，表达载体命名为pShac3载体。
[0073] 对实施例1所得到的pShac3载体的表达能力进行鉴定，具体步骤如下：将pShac3 转化大肠杆菌BL21 (DE3)，用卡那霉素LB平板筛选，获得阳性菌株，挑取阳性菌落接种 4mL含卡那霉素LB培养液，37°C、230rpm震荡培养至少12h，然后以50倍扩大培养，37°C、 230rpm震荡培养4h后，将温度降低至25~30 °C，加入终浓度为0.ImM的IPTG诱导培 养10~12h;离心收集菌体，按每克菌体湿重加IOmL裂解液重悬菌体，用高压均质机以 700bar压力破碎菌体2~6次，离心收集上清，用SDS-PAGE鉴定其表达情况；其中SDS-PAGE 操作程序按照《分子克隆实验指南》第三版进行。鉴定过程中将pShac3转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，获得阳性菌株BL21 (DE3) -Shac3，将BL21 (DE3) -Shac3 扩大培养用IPTG诱导，用 SDS-PAGE鉴定，结果参见图2，图2的结果表明pShac3转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经IPTG诱 导能高效表达0RF2基因，获得Cap蛋白，大小约为28kD，表达量约为500mg/L，表达蛋白具 有可溶性。
[0074] 实施例2
[0075] 利用pShac3载体表达猪圆环病毒2型Cap蛋白，具体步骤如下：
[0076] 1)将pShac3转化大肠杆菌BL21 (DE3)，用卡那霉素LB平板筛选，挑取阳性菌落接 种5mL含卡那霉素LB培养液，37°C、230rpm震荡培养过夜，然后以200倍扩大培养，37°C、 230rpm震荡培养4h后0D6000. 7,将温度降低至25~30°C，加入终浓度为0.ImM的IPTG诱 导培养10~12h;离心收集菌体，按每克菌体湿重加IOmL裂解液重悬菌体，用高压均质机 以700bar压力破碎菌体2~6次，离心收集上清；
[0077] 2)猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化：
[0078] 1)将高压均质机破碎后的菌体离心上清1L，使用50%饱和度硫酸铵进行分级沉 淀，离心收获沉淀；
[0079] 2)用PBS缓冲液200ml溶解，离心弃去沉淀；
[0080] 3)上清加入5 %曲拉通X-114 (IOmL)，冰上混合30分钟，转移至37度水浴30分 钟；
[0081] 4)待溶液浑浊后，高速离心使溶液分层，小心转移水相，弃曲拉通有机相；
[0082] 5)重复步骤3)、4)直到内毒素小于50EU/mL，SDS-PAGE确定猪圆环病毒2型Cap 蛋白浓度为500mg/L;纯化结果参见图3。
[0083] 图3的结果表明通过纯化后已去除大量菌体蛋白，猪圆环病毒2型Cap蛋白得到 有效纯化。
[0084] 实施例3
[0085] -种猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗，包括抗原和佐剂，所述抗为原权利要求8所获 得的猪圆环病毒2型Cap蛋白，猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原和佐剂的体积比为4 : 1，猪 圆环病毒2型Cap蛋白抗原的浓度为37. 5yg/mL;该猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗的制备 方法为：将实施例2中纯化后的猪圆环病毒2型Cap蛋白稀释成浓度为37. 5yg/mL，按比 例加入水佐剂GelST-01，800rpm搅拌IOmin后及制成疫苗。
[0086] 效果验证
[0087] 利用小鼠测定猪圆环病毒2型Cap蛋白的免疫原性试验：将60只Balb/C小鼠随 机分成6组，每组10只，实验方案如下表1。
[0088] 表1 :动物实验方案
[0089]
[0090] 1 ?效价检测
[0091] 检测方法步骤如下：
[0092] 1)将生长良好的单层PK15细胞消化分散后用I. 5%FBS维持液稀释至1. 5~ 2. 0