无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]Trizol、RNase H和Superscript Ilreversetranscriptase试剂盒均购自 Invitrogen公司。DNA聚合酶I购自NEB公司。在cDNA片段上锚定的接头序列购于由 Illumina测序试剂盒。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0038] 抗象绿TC1966和VC6089A，以及感見象绿見VC1973A:记载于"孙雷，程须 珍，王素华，王丽侠，刘长友，梅丽，徐宁.栽培绿V2709抗豆象特性遗传及基因初步定 位.中国农业科学，2008, 41 (5) : 1291-1296中"，公众可从中国农业科学院作物科学研究所 获得。
[0039] 绿豆象：把感豆象绿豆种子如中绿1号放在温度为27°C左右，湿度为70% -80%， 并保持黑暗的养虫室内繁殖并饲养绿豆象。具体参考文献：程须珍，王素华，金达生，王 泮龙，杨又迪.绿豆抗豆象育种品系综合评价.植物遗传资源学报，2003, 4(2) : 110-113。
[0040]实施例1、用于鉴定绿豆对豆象抗性的SSR引物的获得
[0041] 一、RNA-seq分析及SSR引物的设计
[0042](一）转录组数据的获得
[0043] 供试绿豆：绿豆抗、感豆象近等基因系VC6089A与VC1973A。
[0044] 利用Trizol试剂提取开花期后16天的绿豆幼嫩荚RNA(经验证抗豆象基因在开 花期后16天的幼嫩荚中开始表达），用带有Oligo(dT)磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后 加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复，加A并连接测序接头，然后用琼脂糖凝 胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，构建好的测序文库用IlluminaHiseq 2000 进行测序。反转录并合成双链cDNA，纯化cDNA，进行末端修复，加A并连接测序接头，然后 用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增。具体方法如下：
[0045] 1、绿豆TotalRNA的提取
[0046] 采用常规的Trizol法提取，纯化，DNA酶处理，获得浓度彡50ng/iil、总量彡g、 0D260/280为I. 8-2. 2的Total RNA样品（电泳检测和NanoDrop初检，再优选择样品进行 Qubit定量和Agilent2100检测）。
[0047] 2、mRNA的分离及随机打断
[0048] 用带有〇lig〇-dT的磁珠分离出带有polyA的mRNA，然后利用超声波随机打断，回 收200_700bp的片段。
[0049] 3、cDNA第一链和第二链的合成
[0050]cDNA第一链的合成是用随机6聚物和Superscript II reverse transcriptase 试剂盒进行。cDNA第二链是用RNase H和DNA聚合酶I完成。
[0051] 4、在cDNA片段上锚定的接头序列。PCR扩增用上述接头序列中的引物进行15个 循环的PCR扩增。
[0052] 5、文库构建及检测利用上述步骤中得到的序列，按照Illumina公司sampleprep kit进行文库构建及检测。
[0053] 6、RNA-seq的测序
[0054] 将建好的文库以5_7pM的浓度加到Illumina测序仪（GenomeAnalyzerII)的相 应通道上，运行36个循环。
[0055] 7、数据分析
[0056] 剔除杂质数据，对RNA-seq组装后的结果进行整合。之前的步骤得到的是原始数 据，其中含有加入的接头序列，将其去除后称为Clean reads，就可以进行拼接与组装。具体 方法是利用将得到的Cleanreads,采用针对转录组拼接的Trinity(版本：v2012-10-05 ; 参数设置：min_kmer_C〇v为2,其它参数为默认参数）软件进行拼接。用Trinity将测序 序列拼接成一个转录组，以此作为后续分析的参考序列。取每条基因中最长的转录本作为 Unigene0
[0057] 8、生物信息学分析
[0058] 将上述得到的Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和KOG进行 blastx比对（evalue< 0. 00001)，取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果 不同库之间的比对结果有矛盾，则按nr、Swiss-Prot、KEGG和KOG的优先级确定Unigene的 序列方向，跟上述4个库皆比不上的Unigene，用软件ESTScan预测其编码区并确定序列的 方向。对于能确定序列方向的Unigene，给出其从5'到3'方向的序列；对于无法确定序 列方向的Unigene，给出组装软件得到的序列。对这些基因进行了功能注释，包括KOG分类 及GO注释。
[0059](二）SSR引物的识别
[0060] 安装Perl语言，从http://pgrc.lpk-gatersleben.de/misa/ 下载est-trimmer. Pl并运行，去除转录组序列中小于IOObp过短的序列和大于2000bp过长的序列，运行 命令为：C: \perl\bin>perlest-trimmer，piA.fasta-amb= 2, 50_tr5 =T，5, 50_tr3 = A，5, 50-cut= 100, 2000。输出两个文件A.fasta.log和A.fasta.results(A为文件 代号）。从http://www.bioinformatics,org/cd-hit中下载CD_HIT软件，利用其去除 冗余序列：把A.fasta.results复制到cd_hit文件夹中并重命名为B.fasta，运行cd_ hit.exe，Perl环境下运行命令为：C: \perl\bin\cd_hit>cd_hit.exe-lB.fasta-〇C. fasta-cl. 00-n5-M2000,输出三个文件，其中C.fsata文件用于下一步处理（A、B和C均为 文件代号）。从http://pgrc.lpk-gatersleben.de/misa/下载misa.pi程序以识别和定位 序列中的SSR;参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核 苷酸的重复次数至少为1〇、6、5、4、3、3。将C.fsata文件拷贝至C盘perl\bin目录下，Perl 环境下运行命令：0:\口61'1\13；[11>61'1111183.口10.€38，运行后产生0.€38七3.111183和0.€38七&. statistics两个文件，其中C.fasta.misa用于后续引物设计。
[0061](三）SSR引物的设计
[0062] 使用Perl环境下primerf模块批量设计SSR引物：引物设计参数为Tm55-65DC， 引物长度为18_22bp。运行p3_out.pi，Perl环境下运行命令为：C:\perl\bin>perlp3_ in.plC.fasta.misa，产生了一个名为C.fasta.p3in的primer3的输入文件；再复制 C.fasta.p3in文件到C盘perl\bin\primer3\bin根目录下，运行primer3_core.exe 实现批量的引物设计，Perl环境下运行命令为：C: \perl\bin\primer3\bin>primer3_ core.exe〈C.fasta.p3in>C.fasta.p3out，产生一个名为C.fasta.p3out的文件；最后将 C.fasta.p3out文件复制至C盘perl\bin目录下，运行p3_out.pi，其命令为：C: \perl\ bin>perlp3_out.piC.fasta.p3outC.fasta.misa，运行后得到C.fasta.results文件， 即为设计好的引物。
[0063] 二、绿豆高通量抗豆象相关SSR位点的发掘
[0064] 应用上述方法使用抗、感豆象近等基因系VC6089A与VC1973A的幼嫩荚作为材料 进行高通量测序，利用Perl语言对绿豆转录组序列进行高通量SSR位点的发掘，得到48693 条unigenes。SSR密度分布出现频率最高的是单碱基微卫星，所占比例最高的是A/T，其次 是四核苷酸（图1)。
[0065] 使用primer3. 0批量设计软件共设计获得SSR引物3000对，利用绿豆叶片DNA进 行引物设计成功率检测，结果表明，共有651对SSR引物在100-300bp检测到清晰条带，表 明引物设计成功率较高。
[0066] 其中，在抗、感豆象近等基因系VC6089A与VC1973A间多态的引物共有6对，利用 这6对SSR引物来验证F2分离