>[0054] 在内含肽切割位点处存在的脯氨酸残基可能会对该位点的切割产生干扰。有趣 的是，尽管脯氨酸残基是在bFGF的N端-外显肽中发现的（图1D)，但是在JM101 [pWK3R] 培养物中，在前体OmpA-EGF-VMA-bFGF和EGF-VMA-bFGF中，VMA和bFGF之间的切割很高效 地发生，在SN和CL组分都生产了EGF和bFGF(图2A和2B)。推测原因可能是脯氨酸的存 在趋向于在蛋白的螺旋构建体中引入"扭结"，使前体展现出扩展的，因而更开放的结构来 促进切割过程。更进一步，因为中间体VMA-bFGF似乎是不可切割的（图2A，泳道6)，它在 JMI01[pWK3R]的CL和SN中都没有作为中间体存在（图2A，泳道2和3)，支持了这样的假 想：从OmpA-EGF-VMA-bFGF和EGF-VMA-bFGF前体进行的bFGF的切割要么比EGF的切割更 早，要么和EGF的切割同步。
[0055] 值得注意的是，在SN和CL部分中，OmpA-EGF-VMA-bFGF和EGF-VMA-bFGF前体的 切割都是自发进行的（图2A和2B)。从OmpA-EGF-VMA-bFGF和EGF-VMA-bFGF前体进行 bFGF和EGF原位切割的证明和从SN和CL制品中高水平的回收两种多肽呈现了一种从内含 肽-介导的表达中提取回收靶标蛋白的温和方法。但是，结果明显和之前的研究结果明显 矛盾，在之前的结果中显示，外显肽从VMA融合体的释放需要使用还原剂和/或低pH。尽管 本研究的结果有潜在的应用价值，但是仍然需要阐明在SN和CL中检测到的切割活性是否 归因于前面假设的两种前体的扩展结构，或对于它们的表现有其它的解释。
[0056] 尽管如此，在本研究中设计的融合蛋白可以作为研究侧翼序列的改变对VMA切割 影响的卓越模型蛋白。迄今为止，外显肽环境对内含肽切割的影响知之甚少。
[0057]OmpA-EGF-VMA-bFGF在JMI01 [pWK3R]中表达后不久，这个大的（~82kDa)的前体 要么保留在细胞质中要么进入分泌途径；同时，其会在VMA侧翼的两个切割位点处被进行 加工以生产更小的中间体，包括OmpA-EGF-VMA、OmpA-EGF、VMA-bFGF和bFGF;前两种中间体 被期望进行分泌，后两种将会留在细胞质中。值得注意的是，被证明被正确加工以生产真结 构的bFGF分子（表2)，被鉴定为共存在于SN和CL中（图2a，泳道2和3)。这个新发现可 以提供新观念，成熟分泌蛋白在细胞质中的表达不需要通过昂贵的和劳动密集型的传统的 融合工序。
[0058] 总而言之，OmpA-EGF-VMA-bFGF前体及其中间体形成了成熟bFGF和EGF的两个独 立池，一个是分泌池，另一个是胞内池。值得注意的是，JMI01[pWK3R]的细胞沉淀物展示出 比其分泌的bFGF更大的bFGF储备（图2a，泳道2和3 ;图5)。另外，在CL中也检测到了 显著水平的加工过的EGF。推测可能是，在CL中检测到的加工过的EGF在SecYEG通路中 的肽酶切割后被捕获。与之前关于蛋白外排的发现相似，只有低水平的EGF和bFGF在细胞 外周质中被检测到（数据未列出）。这些结果表明了这样的观点：OmpA-EGF-VMA-bFGF的切 割在细胞质中高效发生以释放bFGF。之前企图使用内含肽来形成EGF融合体，然而，导致了 大肠杆菌细胞质中不溶性聚合体的形成。尽管在PWKW2中，在微调的LacUV5盒的控制下， 表达了高水平的OmpA-EGF-VMA-bFGF，这个大前体在细胞中保持溶解的能力对于随后作为 具有生物活性和真产物的EGF和bFGF的获得是至关重要的。
[0059] 另一方面，尽管OmpA-EGF-VMA-bFGF的大尺寸（图2B，泳道4)，但是它也能被很容 易的分泌，推测可能是通过SecYEG的迀移机制来形成外排中间体：EGF-VMA-bFGF(图2B， 泳道3)。但是，显示出，外排中间体能够被赋予高效的自我切割活性以进一步形成真bFGF 和EGF(图2B，泳道3)。一般情况下，被推测形成折叠结构的细胞质蛋白不被限制进入分泌 途径。因此，在EGF-VMA-bFGF的侧翼VMA中，具有EGF和bFGF作为N端和C端的外显肽， VMA的折叠趋势会被压制和阻止。结果就是EGF-VMA-bFGF能够能够分泌的扩展结构。这些 发现对于大范围的胞内蛋白的表达是很重要的，要不然，如果细胞质表达是唯一的选择，细 胞内蛋白可能会以融合蛋白或包涵体而结束。
[0060] 总之，本发明中引入的通用型大肠杆菌系统被证实为至少是真EGF和bFGF或其他 蛋白的尚效共表达制造工厂。
[0061]方法
[0062] 菌株和化学试剂
[0063] 本研究中使用的宿主是大肠杆菌菌株JM101。PhusionPCR试剂盒、限制性内 切酶和修饰酶购自NewEnglandBiolabs(Ipswich，MA，USA)。所有的寡核苷酸购自 Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。如果没有特别说明则其他化学试剂购自Sigma-Aldrich 公司（St.Louis，M0,USA)。抗bFGF和EGF以及作为细胞质内标识物的MazG的抗体在兔体 内制造。
[0064] 表达构建体的构建
[0065] 作为PWKW2的衍生物，pWKW2FGFR，pWKW20VMA和pWK3R是通过下列修饰构建的。 敲除包括LacUV5表达盒的EcoRI-EcoRI的片段，LacUV5表达盒中具有egf基因。首先使 用寡核苷酸P1-P5 (表1)作为引物，使用载体pSO和PWKW2作为模板，通过重叠延伸PCR合 成具有bfgf基因的相同表达盒。然后通过EcoRI限制性内切酶和与PWKW2的重新连接来 生产质粒PWKW2FGFR(图la)。啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae)血管膜ATP酶基因 的SeeVMA内含肽融合到bfgf基因的上游的在质粒pWKW20VMA(图lb)通过以下步骤进行 构建：首先使用PTYB21和pWKW2FGFR构建体作为模板，寡核苷酸P6-P9 (表1)作为引物， 通过重叠延伸PCR形成预期的表达盒，然后是使用Nrul和amHI对表达盒进行限制性酶切， 然后与PWKW2FGFR连接。为了获得质粒pWK3R(图lc)，首先以pWKW2为模板，以寡核苷酸 P10-11 (表1)为引物，使用重叠延伸RCR形成表达盒，然后通过Nrul和Kpnl进行限制性酶 切，并与PWKW20VMA连接。
[0066] 震荡培养
[0067] 大肠杆菌转化子在34°C下，于补充有70yg?ml1氨苄青霉素的MMBL培养基中生 长。在实验进程中，在含有50ml生长培养基的250ml烧瓶中接种新长成的菌落，在34°C下 以250rpm的转速震荡，直到培养物达到A55Q= 8的密度。随后，加入0.ImM的IPTG，所述培 养物继续生长8小时。接下来，将培养物离心，保留上清液（SN)。细胞沉淀使用120yl的 Tris.C1缓冲液（50mM，pH8. 0)重悬，接下来加入83y1的EDTA溶液（0. 25M，pH8. 0)。将 细胞混合物在冰上孵育5分钟，然后37°C下使用120y1的溶菌酶溶液（10mg?ml3处理 20 分钟。加入 83y1 的裂解缓冲溶液（（10mMEDTA，10%TritonX-100,和 50mMTris.Cl， pH8. 0)后，将离心管轻柔颠倒，然后13000rpm转速离心10分钟。上清液就是细胞裂解液物 (CL)。SN和CL部分使用蛋白印迹（WesternBlot)分析bFGF和EGF，分析结果的图像用软 件ImageJ(国立卫生研究院，美国）通过密度分析法进行定量。
[0068] 硫酸铵沉淀
[0069] 将硫酸铵加入到含有bFGF的SN中使其达到35%的饱和度。离心后，将含有bFGF 活性的沉淀物（标记为A)溶解在5ml的50mM的Tris.Cl(pH7. 5)中以用于后续的纯化。对 于上清液，加入硫酸铵使其获得65%的饱和度。通过离心收集含有EGF活性的沉淀物（标 记为B)，并溶解在5ml磷酸盐缓冲液（PB;每升含有1. 44gNa2HP0jP0? 24gKH2P04，pH7. 4) 中以备后续的使用。
[0070] 细胞裂解
[0071]将从400ml培养物（见上述震荡培养）中获得的细胞沉淀物溶解于50mM的Tris.Cl(pH7. 5)中，重悬液使用细胞破碎系统（ConstantSystemsLtd.)在25kPa的压力下重复 5次。将裂解产物在13500rpm转速下离心10分钟，保留上清液以纯化细胞内的bFGF。
[0072]EGF的纯化
[0073] 使用QAE-交联葡聚糖A-25(AmershamPharmacia)离子交换色谱分析法纯 化EGF的方法在之前已经描述过。合并含有EGF活性的部分，使用离心超滤装置（截留 10kDa) (Millipore)过滤。然后，滤液使用Vivaspin500离心过滤装置（截留3kDa)(GE healthcare)在13500rpm的转速下离心1小时进行净化。
[0074]EGF的分析
[0075] 纯化的EGF使用装配有在355nm操作的smartbeam-II激光器的Bruker ultrafleXtremeMALDI-T0F/T0F质量光谱仪（BrukerDaltonics，Bremen，德国）进行分 析。使用？161&3111：1'〇1(版本3.3，131'111^1〇311：011；[08)软件来控制仪器的操作。通过操作 人员调节MALDI激光器强度以获得质谱的最适强度和分辨率。将1y1的样品和1y1的基 质芥子酸（BrukerDaltonics)预混合，然后将混合物涂抹（spot)到GroundSteel革巴板 (BrukerDaltonics)上。使用蛋白校准基准物I(BrukerDaltonics)来进行外部校准。在 质谱分析法实验中使用线性模式以获得正离子质谱。
[0076]bFGF的纯化分析
[0077] 使用肝素琼脂糖凝胶色谱分析法纯化bFGF，纯化的bFGF使用之前描述的液相色 谱-质谱联用进行分析。
[0078]EGF和bFGF的生物测试
[0079] 纯化的EGF