。使用磷酸钾缓冲液。
[0064]
[0065] 在室温下连续过夜摇动之后，用pH5.0的0. 1MNaOAc清洗珠子3次。最后，将含 有固定化的EndoPro的珠子悬浮在相同的缓冲液中并存在4°C。
[0066] 实施例2.固定在4个不同Purolite载体上的EndoPro的酉每活性
[0067] 使用乙酸酯-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-对-硝基苯胺（Ac-AAP-pNA)作为底物， 将EndoPro活性测定为0D405nm/分钟。随时间形成的释放的硝基苯胺（pNA)的量是对 EndoPro活性的测量，并使用Tecan GENios以分光光度法在405nm下测定。
[0068] 将未固定化的EndoPro或固定在4个Purolke?载体中的一个上的固定化的 EndoPro加入到微量滴定板中pH 5. 0的(λ 1M NaOAc中。在加入在pH 5. 0的(λ 1M NaOAc 中的3mM Ac-AAP-pNA(终浓度）储液之前，将酶在40°C下孵育5分钟。开始动力学测量并 由曲线的斜率计算活性。作为从底物Ac-AAP-pNA释放的pNA的结果，酶活性被测定为在 405nm的吸光度随时间的增加（0D 405nm/分）。
[0069] 图1显示：固定在Purolite?载体ECR8310、-8319和-8417上的EndoPro显示出 活性。固定在Purolite?载体ECR83214上的EndoPro没有检测到活性。因此，没有进行该 特定制品的进一步研究。
[0070] 实施例3.伸用固宙化的EndoPro,从耒芽汁中除去小耒醇溶蛋白
[0071] 为了检测固定在Purolite?载体ECR8310、-8319和-8417上的EndoPro是否对谷 蛋白也有活性，分别将0. 05mg酶，固定化的和游离的EndoPro(对照）加入到在15ml反应管 中的10ml麦芽汁（ResearchBrewerySt.Johann,Train-St.Johann,德国；批号：4/2013) 中。
[0072] 将混合物在室温下摇动过夜。第二天，通过如方法中所述的过程测定麦芽汁中的 谷蛋白含量。图2中的结果显示了麦芽汁中的残余小麦醇溶蛋白的含量。
[0073] 我们发现：当根据实施例1中所述的方法固定在Purolite?ECR8319载体上时，固 定化的EndoPro具有对大的蛋白底物的最佳活性，相比之下，当在不同条件（pH 8. 2,摩尔 浓度为35mM，酶载量为80mg/g载体）下固定在相同载体上时，仅获得了约一半的对谷蛋白 的活性（数据未示出）。
[0074] 实施例4.与在40°C下相比，固宙化的和游离的EndoPro在4°C下的相对活件
[0075] 与在40°C下的活性相比，为了测定在4°C下的相对活性，将未固定化的和固定化 的EndoPro Purolite? ECR8319(如上文所述固定化的制品）酶加入到lml总体积包含3mM Ac-AAP-pNA的pH 5. 0的0· 1M NaOAc中。在蓄热调温混合器（Eppendorf)中以900rpm摇 动反应混合物。每分钟取出上清液样品并用0. 5M HC1 (样品/HC1比率为50/1 (体积/体 积））终止反应。用Tecan GENios以分光光度法测量在405nm的吸收度。将在4°C下的斜 率（0D 405nm/分）与在最佳活性温度40°C下的斜率进行比较。在4°C和40°C下，固定化的 EndoPro绝对活性分别为0. 53和1. 850D 405nm/分钟，未固定化的EndoPro绝对活性分别 为0. 06和0. 650D 405nm/分钟。在40°C下的活性被设定为100 %。
[0076] 图3显示：在4°C下，固定化的EndoPro的相对活性是未固定化的EndoPro的相对 活性的3倍。
[0077] 实施例5.在4°C和15°C下，利用固宙化的EndoPro转化啤酒中的小耒醇溶蛋白
[0078] 将三种不同体积（表3)的如实施例1中所述固定在Purolite?ECR8319制品上的 固定化的EndoPro用移液器加入到50ml啤酒（ResearchBrewerySt.Johann,Train-St. Johann，德国；批号：42/2012)中。分别在4°C和15°C下，在滚轴混合器上孵育混合物，0.5 小时、1小时、19小时和24小时之后，取出lml啤酒样品。通过方法中所述的过程测定样品 中的残余小麦醇溶蛋白。结果被描述在表3中，其显示了啤酒中的小麦醇溶蛋白的减少。总 而言之，固定化的EndoPro能够在4°C的温度下降解啤酒中的小麦醇溶蛋白达到与在15°C 下相同或相似的程度。24小时之后，所有样品中的小麦醇溶蛋白被降解至不可检测的限度 (L0D2. 5ppm)。通过使用较高剂量的固定化的EndoPro(10ml)，小麦醇溶蛋白甚至可在孵育 1小时后被降解至不可检测的限度。
[0079]表3依据时间_、剂量-和温度的通过固定化的EndoPro从啤酒中去除小麦醇溶蛋 白。残余的小麦醇溶蛋白的浓度被表示如下：（+++) ?2. 5ppm小麦醇溶蛋白，（++) >2. 5ppm， (+)彡2. 5ppm，（-)无小麦醇溶蛋白。
[0080]
_] Mik
[0082] 实施例1-5中所示的结果显示：根据本发明的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶 能够转化复杂的底物例如谷蛋白。
【主权项】
1. 固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶，其中所述脯氨酸特异性内切蛋白酶被固定在载 体上，所述载体包含已用二亚甲基官能化的甲基丙締酸醋。2. 根据权利要求1的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶，其中所述载体的粒径范围为 100-400μm〇3. 根据权利要求1或2的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶，其中所述载体的孔径分 布d50 为 1500-2100A。4. 根据权利要求1-3中任一项的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶，其中所述脯氨酸 特异性内切蛋白酶源自Aspergillus,优选地源自Aspergillusniger.。5. 生产根据权利要求1-4中任一项的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶的方法，所述 方法包括：用双官能交联剂激活氨基官能化的甲基丙締酸醋载体中的氨基基团，将所述脯 氨酸特异性内切蛋白酶固定在所述载体上和生产所述固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶。6. 根据权利要求5的方法，其中所述脯氨酸特异性内切蛋白酶W0. 01-0. 07重量/重 量的酶：载体比率被固定在所述载体上。7. 根据权利要求5或6的方法，其中所述双官能交联剂是戊二醒。8. 根据权利要求5-7中任一项的方法，其中所述固定在10°C-50°C之间的溫度下进行。9. 根据权利要求5-8中任一项的方法，其中所述固定在6-8之间的抑下进行。10. 根据权利要求5-9中任一项的方法，其中所述固定进行4-48小时。11.生产啤酒的方法，所述方法包括W下步骤： a. 制备浆体， b. 发酵啤酒，和 C.使啤酒稳定化， 其中将所述啤酒与根据权利要求1-4中任一项的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶 一起解育，和生产所述啤酒。12. 根据权利要求11所述的方法，其中在使所述啤酒稳定化期间或使所述啤酒稳定化 之后，解育所述固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶。13. 根据权利要求11或12的方法，其中所述解育在0°C-20°C之间的溫度下进行。14. 根据权利要求11-13中任一项的方法，其中所述解育包括水解谷蛋白。15. 根据权利要求1-4中任一项的固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶的用途，所述用 途是将谷蛋白水解为无毒的片段。
【专利摘要】本发明涉及固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶，其中所述脯氨酸特异性内切蛋白酶被固定在载体上，所述载体包含已用二亚甲基氨基官能化的甲基丙烯酸酯且所述载体粒径范围为100-400μm。本发明还涉及生产啤酒的方法，所述方法包括以下步骤：制备浆体、发酵啤酒和使啤酒稳定化，其中所述啤酒与固定化的脯氨酸特异性内切蛋白酶一起孵育。
【IPC分类】C12N11/08, C12H1/00, C12N9/62, C12C5/00
【公开号】CN105247048
【申请号】CN201480030782
【发明人】爱达·海赛尼, 艾格·加拉伊弗, 鲁波·伊登斯
【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年6月2日
【公告号】EP3004344A1, US20160102300, WO2014191571A1