80腹水瘤细胞悬液，调整细胞溶度为（1~ 2) X 107个/mL，立即接种到昆明小鼠的腹腔，接种量为2X 106~4X 106个S-180细胞。
[0123] 接种完称重，随机分为荷瘤对照组（生理盐水）、阳性对照组（环磷酰胺20mg/ Kg · d)、多糖（AbnplOOl、Abnp100 2、AbaplOOl、Abap100 2)处理组（40mg/Kg · d)以及联合 处理组，每组10只，接种后24h就开始给药，按体重比（lOmg/Kg)、腹腔给药，每日一次，其 中联合处理组在腹腔先给药（按20mg/Kg ·(!环磷酰胺腹腔注射给药）后4h分别尾静脉注 射 4mg/mL 多糖（Abnp100 1、Abnp100 2、Abap100 1、Abap100 2)，连续 7d，观察 30d，逐日记录小 鼠的死亡情况，计算各组的平均生存时间（AST)、中位生存时间（MST)、生命延长率（ILS)= (T/C-l) X 100%，其中T为治疗组的平均生存时间、C为荷瘤对照组平均生存时间。实验 结果如下表：
[0124] 活性多糖对S180腹水瘤小鼠生存期的影响：（I ±s:)
[0126] 结论：环磷酰胺是常用的氮芥类的抗肿瘤药物，该药在体外无活性，进入体内后 在肝脏或血液中进行活化，生成烷基化的代谢产物，进而发挥抗肿瘤的作用，从以上数据 可知，阳性对照组（环磷酰胺20mg/Kg ·(!)与荷瘤对照组相比较，阳性对照组的S180腹水瘤 小鼠生存时间延长了 60. 37%，这充分体现了环磷酰胺的抗肿瘤活性，多糖处理组与荷瘤对 照组相比较，AbnplOOl处理组、Abnp100 2处理组、AbaplOOl处理组、Abap100 2处理组的S180 腹水瘤小鼠生存时间分别延长了 16. 04%、26. 42%、30. 19%、22. 26% (p〈0. 01)。可见，本 发明的到的活性多糖AbnplOOl、Abnp100 2、AbaplOOl、Abap100 2,能够明显延长S180腹水 瘤小鼠的生存时间；另外以上联合处理组与荷瘤对照组相比较，AbnplOOl与环磷酰胺联合 处理组、Abnp100 2与环磷酰胺联合处理组、AbaplOOl与环磷酰胺联合处理组、Abap100 2与 环磷酰胺联合处理组的S180腹水瘤小鼠生存时间分别延长了 54. 71%、57. 55%、61. 32%、 55. 66% (ρ〈0· 01)，虽然这4组的生存延长时间不及阳性对照组（环磷酰胺20mg/Kg · d)， 但是也可以充分说明AbnplOOl、Abnp100 2、AbaplOOl、Abap100 2能够延长S180腹水瘤小鼠 的生存时间，且从以上数据可知：Abnp 1001、Abnp 1002、AbaplOOl、Abap 1002中的AbaplOOl 相比其他3中活性多糖，AbaplOOl能更好的延长S180腹水瘤小鼠的生存时间。
【主权项】
1. 一种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖AbaplOOl，其特征在于：它的 单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖的摩 尔比为 〇· 4:0. 02:0. 4:73. 6。2. -种由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abap100 2,其特征在于：它的 单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，且阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖的摩尔 比为 1. 3:0. 14:0. 2:76. 73。3. -种活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：它包括以下工艺步骤： (1) 材料预处理：收集蘑菇罐头加工过程中产生的工业废水，然后对该工业废水进行 旋转蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35~55%，得到蘑菇预煮浓缩液；量取一定量的蘑 菇预煮浓缩液，在蘑菇预煮浓缩液中加入等体积的去离子水进行混合，混合后在65-75Γ水 浴条件下将蘑菇预煮浓缩液中析出的晶体完全溶解，溶解之后离心机离心，离心机的转速 控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25°C，离心时间为10_20min，离心之后取上 清液，上清液用90-150KDa的超滤膜超滤，将超滤得到的截留液，按体积比为1:3. 5-1:2. 5 的比例加入乙醇，在室温下醇沉过夜，醇沉得到的沉淀用50~100ml去离子水溶解，并于 65-75°C减压蒸馏除去乙醇，再次离心机离心，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间， 离心温度为15-25°C，离心时间为10_20min，收集上清液，即得到不小于lOOKDa的粗多糖 Abcp，采用苯酚-硫酸法测Abcp的多糖含量，3. 5-5°C保存备用； (2) 离子交换柱层析： a. DEAE-52预处理：将DEAE-52进行酸、碱预处理； b. 经柱层析得粗多糖AbaplOO; (3)Abapl00的SephadexG-200凝胶柱层析： a. SephadexG-200预处理； b. 经柱层析得活性多糖。4. 根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤（2)中DEAE-52 预处理的具体过程为：在DEAE-52中加入蒸馏水，浸泡过夜后抽滤，先用0. 45-0. 55mol/L的 NaOH-NaCl碱洗，用蒸馏水洗至中性；用0. 45-0. 55mol/L的HC1酸洗，用蒸馏水洗至中性； 用0. 45-0. 55mol/L的NaOH-NaCl浸泡，最后用蒸馏水洗至中性即可。5. 根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤（2)的b工 艺具体为：将预处理后的DEAE-52进行沸水浴脱气，脱气时间为10-20min，脱气之后冷却 装柱，用0. 015-0. 025mol/L、pH为7. 1-7. 3的Tris-HCl缓冲液洗至分层明显，之后注入 DEAE-S印hadex-A50,将层析柱连接到组合紫外检测仪和HW-2000色谱工作站，定时为5~ 20min/管，用 0· 015-0. 025mol/L，pH为 7. 1-7. 3Tris-HCl缓冲液洗平衡后上Abcp，待Abcp 进入DEAE-52的界面时，开始平衡洗脱，先用0. 015-0. 025mol/L，pH为7. 1-7. 3的Tris-HCl 缓冲液洗脱平衡，收集主峰A的洗脱液； 当收集完主峰A的洗脱液之后，层析柱继续用0. 1~0. 5mol/L连续梯度溶度的NaCl溶液进行洗脱，控制流速为〇. 15-0. 25mL/min，进行部分收集，每5~20min收集1管，每管 的量是2~10mL，采用苯酚-硫酸法测偶数管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量 分布图，再根据多糖含量分布图与洗脱谱图收集主峰B的洗脱液，合并主峰B的洗脱液，主 峰B的洗脱液经4. 5-5. 5KDa超滤膜超滤脱盐，超滤得到的截留液进行离心机离心，离心机 的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25°C，离心时间为10-20min，收集上清 液，即得酸性粗多糖AbaplOO。6. 根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤（3)中所述 SephadexG-200预处理的具体工艺为：将SephadexG-200干胶浸泡在蒸馏水中，不断搅 拌，放置于室温下膨胀45-50h，并除去表面的碎片和沉降缓慢的细小颗粒，之后利用真空干 燥器除尽凝胶液中的空气。7. 根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤（3)的b工 艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检 测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品 AbaplOO,待样品完全进入填料界面时用0. 015-0. 025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为 0. 15-0. 250mL/min，分部收集，每5~20min收集1管，每管的量是2~10mL，用苯酚-硫酸 法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱 谱图，收集主峰E的洗脱液，合并主峰E的洗脱液，对主峰E的洗脱液用4. 5-5. 5KDa超滤膜 进行超滤到9-1lmL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abap1001。8. 根据权利要求3所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤（3)的b工 艺具体为：将预处理后的SephadexG-200填入层析柱中，将层析柱连接到组合紫外检 测仪和HW-2000色谱工作站，用去离子水洗平衡，平衡后使液面降至填料界面时上样品 AbaplOO,待样品完全进入填料界面时用0. 015-0. 025mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速为 0. 15-0. 250mL/min，分部收集，每5~20min收集1管，每管的量是2~10mL，用苯酚-硫酸 法测各管多糖浓度，根据所测得数据，绘制成多糖含量分布图，根据多糖含量分布图与洗脱 谱图，收集主峰F的洗脱液，合并主峰F的洗脱液，对主峰F的洗脱液用4. 5-5. 5KDa超滤膜 进行超滤到9-llmL，进行冷冻真空干燥后，得多糖纯品Abapl002。9. 根据权利要求3或5所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在于：步骤（2)的b步 骤中：所选用的层析柱为2. 6cmX50cm层析柱，DEAE-52填料填的高度为柱高的2/5-3/5，填 入DEAE-Sephadex_A50的高度为8-llcm，Abcp的上样量为5-10毫升。10. 根据权利要求3或7或8中的任意一项所述的活性多糖的提取纯化工艺，其特征在 于：步骤（3)的b步骤中：所选用的层析柱为2. 6cmX50cm层析柱，SephadexG-200填入的 尚度为35_45cm，AbaplOO的上样量为5-10毫升。11. 根据权利要求1所述的活性多糖AbaplOOl的应用，其特征在于：在制备治疗急性 肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。12. 根据权利要求2所述的活性多糖Abap100 2的应用，其特征在于：在制备治疗急性 肝损伤药物以及抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺以及应用，由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abap1001，它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖Abap1002，它的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖以及葡萄糖，一种活性多糖的提取纯化工艺，它包括以下工艺步骤：材料预处理、离子交换柱层析、Sephadex？G-200凝胶柱层析，本发明的活性多糖Abap1001、活性多糖Abap1002具有良好的生物活性，本发明的纯化工艺简单易行。
【IPC分类】A61P35/00, C08B37/00, A61P1/16
【公开号】CN105315383
【申请号】CN201510679731
【发明人】潘裕添, 黄家福
【申请人】闽南师范大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年10月19日