的方法确定调整后的候选引物 是否存在偏向性，如果仍存在偏向性，可W根据偏向性结果进一步对候选引物进行调节，直 到所有候选引物均没有明显的扩增偏向性。
[0066] 由此，本发明的扩增可变区的方法，可W有效消除由引物之间的影响而引起的扩 增偏向性，获得的扩增产物没有明显的偏向性，真实可靠。
[0067] 在本发明的第Η方面，本发明提供了一种测序方法。根据本发明的实施例，参照图 4,该方法包括W下步骤：
[0068]S301;利用前面所述的方法对含有可变区的核酸样本进行多重PCR扩增，W便获 得第Η扩增产物。
[0069]S302;对所述第Η扩增产物进行第Η测序，W便获得第Η测序结果。
[0070]根据本发明的实施例，利用IlluminaHiSeq、IlluminaMiSeq、IlluminaMiSeqDx HiseqXten、LifeSOLiD、IonTorrent、IonPGM、IonProton、Roche454 和单分子测序 平台中的至少一种对所述第Η扩增产物进行所述第Η测序。由此，能够快速有效地获得第Η测序结果，且操作方便、成本低廉。
[0071]由此，利用本发明的测序方法获得的测序结果真实可靠，没有明显的偏向性。
[0072] 在本发明的第四方面，本发明提供了一种确定可变区扩增引物是否存在偏向性的 装置100。根据本发明的实施例，参照图5,该装置100包括：
[0073] 第一扩增组件101，所述第一扩增组件101中设置有通用引物组，用于对含有可变 区的核酸样本进行第一扩增，W便获得第一扩增产物。
[0074] 根据本发明的实施例，所述通用引物组包括通用正向引物和通用反向引物，所述 通用正向引物的识别位点在所述候选正向引物的识别位点的上游，所述通用反向引物的识 别位点在所述候选反向引物的识别位点的下游。
[0075] 根据本发明的实施例，所述通用正向引物的识别位点在V区，所述通用反向引物 的识别位点在J区或C区。由此，利用通用引物组可W有效扩增基因的可变区。
[0076] 根据本发明的实施例，所述通用正向引物的识别位点在FR1区，所述通用反向引 物的识别位点在FR4区。由此，利用通用引物组可W有效扩增可变区全长序列。由于该区 域基因多样性较差，只需要设计几条扩增引物即可W扩增所有V基因。
[0077] 根据本发明的一个具体示例，所述通用正向引物的识别位点在TCR或BCR的FR1 区。所述通用反向引物的识别位点在TCR或BCR的C区。
[0078] 根据本发明的实施例，所述含有可变区的核酸样本为DNA或RNA。其中，所述含有 可变区的核酸样本可W为健康人外周血。进一步的，可W直接从全血提取DNA或RNA样品， 也可W向分离单个核细胞，再从单个核细胞提取DNA或RNA样品。
[0079] 第一测序组件102,所述第一测序组件102用于对所述第一扩增产物进行第一测 序，W便获得所述第一测序结果。
[0080] 根据本发明的实施例，所述第一测序组件为读长不低于4(K)bp的测序平台，所述 读长不低于 400bp的测序平台为选自IlluminaMiSeq、IlluminaMiSeqDx、IonPGM、Roche 454和单分子测序平台中的至少一种。
[0081] 第二扩增组件103,所述第二扩增组件103中设置有候选引物组，用于对所述第一 扩增产物进行第二扩增，W便获得第二扩增产物。
[0082] 根据本发明的实施例，所述候选引物组包括候选正向引物和候选反向引物，所述 候选正向引物的识别位点在V区，所述候选反向引物的识别位点在J区或C区。由此，利用 候选引物组可W有效扩增基因的可变区。
[0083] 根据本发明的实施例，所述候选正向引物的识别位点在FR3区，所述候选反向引 物的识别位点在FR4区。由此，利用候选引物组可W有效扩增CDR3区。由于该区域基因多 样性较高，因而，需要设计多对扩增引物对CDR3区进行扩增，即所述候选引物组包括多对 扩增引物。
[0084]根据本发明的一个具体示例，所述候选正向引物的识别位点在TCR(包括TRB、 TRA、?)，TRG)或BCR(包括IGH，I化，IGK)的FR3区。所述候选反向引物的识别位点在TCR 或BCR的J区。
[0085] 第二测序组件104,所述第二测序组件104用于对所述第二扩增产物进行第二测 序，W便获得第二测序结果。
[0086] 根据本发明的实施例，所述第二测序组件的读长不低于l(K)bp的测序平台，所 述读长不低于lOObp的测序平台为选自IlluminaHiSeq、IlluminaMiseq、Illumina MiSeqDx、HiseqXten、LifeSOLiD、IonTorrent、IonPGM、IonProton、Roche454 和单 分子测序平台中的至少一种。
[0087] 比较组件105,所述比较装置105用于将所述第二测序结果与预定的第一测序结 果进行比较，W便确定所述候选引物是否存在偏向性。
[0088] 根据本发明的实施例，所述将第二测序结果与所述第一测序结果进行比较是指： 基于第一测序结果和第二测序结果，分析V基因和J基因使用的频率W及CDR3区序列的相 关性，然后W第一测序结果为标准模板，评价候选引物组的扩增偏向性。
[0089] 在本发明的第五方面，本发明提供了一种扩增可变区的设备1000。根据本发明的 实施例，参照图6,该设备1000包括：
[0090] 前面所述的装置100。
[0091] 调节装置200;所述调节装置200用于基于所获得的偏向性结果，对候选引物组进 行调节，W便获得调节后的候选引物组。
[0092] 根据本发明的实施例，所述对候选引物组进行调节为改变扩增不足和扩增过多的 候选引物的序列或者改变所述扩增不足和扩增过多的候选引物在所述候选引物组中的浓 度。
[0093] 根据本发明的一个具体示例，基于所获得的偏向性结果，挑选出扩增小于标准模 板的1. 5倍或2倍W上的候选引物W及扩增大于标准模板的1. 5倍或2倍W上的候选引物， 然后重新设计或改变送些引物在候选引物组中的浓度。
[0094] 第Η扩增装置300,所述第Η扩增装置300中设置有所述调节后的候选引物组，用 于对含有可变区的核酸样本进行第Η扩增。
[0095] 利用本发明的该设备，能够有效实施前面所述的扩增可变区的方法，能够消除由 引物之间相互影响引起的扩增偏向性，获得的扩增产物没有明显的扩增偏向性，且该设备 操作简单、方便快捷，成本低廉。
[0096] 在本发明的第六方面，本发明提供了一种测序系统。根据本发明的实施例，参照图 7,该系统10000包括：
[0097] 前面所述的设备1000,所述设备1000用于对含有可变区的核酸样本进行扩增，W 便获得扩增产物。
[0098] 第Η测序设备2000,所述第Η测序设备2000用于对所述扩增产物进行第Η测序， W便获得第Η测序结果。
[0099] 根据本发明的实施例，所述第Η测序设备为选自Illumina化Seq、Illumina MiSeq、IlluminaMiSeqDxHiseqXten、LifeSOLiD、IonTorrent、IonPGM、IonProton、 Roche454和单分子测序平台中的至少一种。由此，能够快速有效地获得第H测序结果，且 操作方便、成本低廉。
[0100] 该系统能够有效实施前面所述的测序方法，获得的测序结果真实可靠，没有明显 的偏向性，且该系统操作容易，成本较低。
[010。 实施例1 ;评价IGH引物扩增的偏向性
[0102](一）实验部分
[0103] 1)抽取健康个体的外周血，分离PBMC(单个核细胞），提取RNA，并将得到的RNA用 C区特异性引物反转录成cDNA。
[0104]。设计IGH可变区的全长扩增引物，正向扩增引物设计在FR1区域，反向扩增引物 设计在C区。扩增引物序列见表1。
[0105] 表1JGH可变区全长扩增引物组合
[0106]
[0107]
[0108] 3)用IGH可变区全长扩增引物对RNA进行扩增，将扩增产物构建IlluminaMiseq 测序文库。
[0109] 4)在Miseq平台进行双末端各250bp测序，测序后将同一条双末端序列组装成一 条序列。
[0110] 5)将步骤3)的IlluminaMiseq测序文库用IGHCDR3区扩增引物组合进行扩增， 将扩增产物构建IlluminaMiseq测序文库。
[0111]6)在Illumin址iseq2000测序平台上进行双末端各150bp测序，测序后将同一 条双末端序列组装成一条序列
[011引（二）数据分析
[0113] 测序所得的原始数据的基本分析过程主要包括W下步骤：
[0114] 将Miseq和Hiseq测序文库首先进行数据处理，对测序所得的原始数据进行去污 染、去接头和去低质量过滤。然后分别与IGH胚系基因V区和J区的参考序列（见如下数 据库ht1:p://www.imgt.org/vquest/refsecih.html)进行比对，确定每条序列所用的V基因 及J基因，并获取每一条序列的CDR3区域。将Miseq测序数据作为标准，评价Hiseq测序 数据，及CDR3区扩增引物的扩增偏向性。
[011引 （S)结果展示
[0116]IGHCDR3区扩增引物组合物扩增结果中各J基因使用频率与扩增前（Miseq测序 结果）的比较结果见图8,IGHCDR3区扩增引物组合物扩增结果中各V