[0102]上游引物PrimerU 1μ1 ;
[0103]下游引物PrimerL1μ1 ;
[0104]DNA模板χμL;
[0105] 灭菌蒸馈水25μ1 ---上述总体积；
[0106]PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0107] 实施例2
[0108] 样本处理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0109]DNA提取，取200μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0110] 1)加200μ1BufferBL，震荡混合，于70°C解育10分钟；
[0111] 。加200μ1无水乙醇震荡混合约20秒；
[011引3) 12000巧m离屯、1分钟；
[0113] 4)取上清转入收集柱中，12000巧m离屯、2分钟；
[0114] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分钟；
[011引6) 12000巧m离屯、2分钟；
[011引7)加入 700μ1washBuffer, 12000巧m离屯、2 分钟；
[0117] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1washBuffer, 12000巧m离屯、2分 钟；
[0118] 9)弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[0119] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 溫放置l-2min，12000巧m离屯、2分钟，滤液即为模板DNA;
[0120] PCR扩增
[0121] PCR反应体系：
[012引10XPCRBuffer2. 5μ1 ;
[0123]HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
[0124] dNTPmix2μ1 ；
[01巧]上游引物PrimerU1μ1 ;
[0126]下游引物PrimerL1μ1;
[0127]DNA模板χμL;
[012引灭菌蒸馈水25μ1 ---上述总体积；
[0129]PCR产物电泳：1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0130]PCR产物纯化
[013。 每管内加入100μΙPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000巧m离屯、2min;
[0132]弃收集管内液体，加入 700ulwashingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[0133]弃收集管内液体，加入 400ulwashingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[0134] 弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[0135] 柱内加入30ul70°C预热洗脱液，12000巧m离屯、3min;
[0136] 测序反应
[0137]反应体系：0. 8ulBi曲ye+1. 5ulBi曲yeSeqBuffer+3ul引物+lulPCR纯化产 物+3. 5uld地2〇;
[0138] 测序PCR热循环条件：
[0139] 1)变性的条件，96°ClOsec;
[0140] 8)退火的条件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25个循环；
[01川9)延伸的条件，60°C4min;
[0142] 10)4°C保溫；
[0143] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的溫度后开始计算；
[0144] 测序产物纯化
[014引 lOul反应体系，96孔板，酒精法；
[014引 1)每管加入100μL100%酒精，然后震荡混匀，室溫放置15min;
[0147] 2) 10°C，4000巧m离屯、30min，马上倒置，1200巧m离屯、Imin;
[014引 3)每管加入100μΙ70%酒精，离屯、15min;5°C，3600巧m离屯、30min，马上倒置， 1200巧m离屯、Imin;
[0149] 4)室溫挥发净酒精，加入10μLHi-Di化rmamide溶解DM;
[0150] 5)95°(：变性5111111，4°(：保溫4111111，加样上机；
[0151] PCR检测，包括：
[0152] 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔.
[0153] 在PD基因突变位点两端设计Ξ对特异性引物；
[0154] 所述引物GBA-F的核巧酸序列为：
[01巧]5' -AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'，
[0156] 所述引物GBA-R的核巧酸序列为：
[0157] 5'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3',
[015引所述LR服2-F1引物的核巧酸序列为：
[0159] 5'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'，
[0160] 所述LR服2-R1引物的核巧酸序列：
[0161] 5'-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'；
[0162] 所述LR服2-F2引物的核巧酸序列为：
[0163] 5'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3',
[0164] 所述LR服2-R2引物的核巧酸序列：
[01巧]日'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'，
[0166] 所述引物PCR扩增出目的片段模板；
[0167] 所述目的片段的获取包括：W上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-2化g/μL作为检 测阴性对照用；
[016引 2) 25μL反应体系检测：
[0169] PremixTaqPCRMas化rMlX 12.5μ1 DNA模板 l-lOng/jiL Prim就U 终浓度为400nM
[0170] PrimerL 终浓度为400nM 灭菌蒸馈水 Up化25叫
[0171] 混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检 测；
[0172] 结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
[0173] 所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95°C预变性5min，94°C变性30sec， 61°C退火30sec，72°C延伸Imin，共循环35次，最后于72°C延伸lOmin。
[0174] 所述引物GBA的扩增产物序列是：
[0180] 实施例3
[0181] 样本处理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0182]DNA提取，取200μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[018引1)加 200μ1Buffer6以震荡混合，于70°C解育10分钟；
[0184] 2)加200μ1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0185] 3) 12000巧m离屯、1 分钟；
[018引4)取上清转入收集柱中，12000巧m离屯、2分钟；
[0187] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分钟；
[018引6) 12000巧m离屯、2分钟；
[0189] 7)加入 700μ1wash Buffer,12000巧m离屯、2 分钟；
[0190] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1wash Buffer,12000巧m离屯、2分 钟；
[0191] 9)弃收集管内液体，12000;rpm离屯、2min;
[0192] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 溫放置l-2min，12000巧m离屯、2分钟，滤液即为模板DNA;
[019引PCR扩增[0194] PCR反应体系：
[019引 10XPCRBuffer2. 5μ1 ;
[0196]HotStarTaqDMPolymerase按kit标准调整；
[0197]dNTPmix2μ1 ；
[0198]上游引物PrimerU1μ1;
[0199]下游引物PrimerL1μ1;
[0200] DM模板Xμ1 ;
[0201] 灭菌蒸馈水25μ1 ---上述总体积；
[0202] PCR产物电泳：1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[020引 PCR产物纯化
[0204] 每管内加入100μ1PCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000巧m离屯、2min;
[020引 弃收集管内液体，加入700μ1washingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[0206]弃收集管内液体，加入 400μ1washingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[0207] 弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[020引柱内加入30μ1 70 °C预热洗脱液，12000巧m离屯、3min;
[0209] 测序反应
[0210] 反应体系：0. 8μ1Bi曲ye+1. 5μ1Bi曲yeSeqBuffer+3μ1 引物+1μ1PCR纯 化产物 +3. 5μ1dd&0 ;
[02·Μ] 测序PCR热循环条件：
[0212] 1)变性的条件，96°ClOsec;
[021引 11)退火的条件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25个循环；
[0214] 12)延伸的条件，60°C4min;
[0215] 13)4°C保溫；
[0216] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的溫度后开始计算；
[0217] 测序产物纯化
[0引引lOul反应体系，96孔板，邸TA法；
[0219] 1)每管加入1μ1 125mM邸TA到管底，室溫放置15min;
[0220] 2) 10°C，4000巧m离屯、30min，马上倒置，1200巧m离屯、Imin;
[02川 3)每管加入100μl70%酒精，离屯、15min;5°C，3600巧m离屯、30min，马上倒置， 1200巧m离屯、Imin;
[022引 4)室溫挥发净酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DNA;
[022引 5) 95°C变性5min，4°C保溫4min，加样上机；
[0224] PCR检测，包括：
[0225] 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔；
[0226] 在PD基因突变位点两端设计Ξ对特异性引物；
[0227] 所述引物GBA-F的核巧酸序列为：
[0228] 5'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3' ，
[0229] 所述引物GBA-R的核巧酸序列为：
[0230] 5,-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3,，
[0231] 所述LR服2-F1引物的核巧酸序列为：
[0232] 5'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3' ，
[0233] 所述LR服2-R1引物的核巧酸序列：
[0234] 5'-AAGATGGTG