剂盒相同，检测步骤和方法也与实施例1相同，用于检测检测其他手足口病毒和肠道 病毒，其结果如图3所示，图中所示为扩增非CA6病毒之背景噪音峰。
[0104] 由图3分析可知，本试剂盒对正常人咽拭子样本、或者CA16、CA10、CA7、CA9、CB2、 CB5、CB13、ECH019以及EV71感染样本并无扩增曲线，检测结果均为阴性，阴性符合率为 100%，说明该试剂盒具有良好的特异性以及具有很高的准确性。
[0105] 实施例3
[0106] 本实施例提供一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其组成同实施例 1的试剂盒相同，检测步骤和方法也与实施例1相同，本试剂盒的内标扩增曲线图如图4所 示，说明本实施例提供检测试剂盒的PNA提取扩增方法不会产生抑制特异性PCR反应之物 质，能有效监控反应。
[0107] 实施例4
[0108] 本实施例提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其组成同实施例1 的试剂盒相同，检测步骤和方法也与实施例1相同，本试剂盒的标本稀释扩增曲线图如图5 所示，图中所示Ct值最小为40左右，则该试剂的检测灵敏度为Ct40,所以通过实验证明，该 试剂盒可以在样本浓度极低的情况下检测。
[0109] 综上分析可知，本发明提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒仅能检 测出CA6-RNA，而不能检测出其他病原体RNA，并且检测灵敏度、准确度和稳定性高，检测灵 敏度可达50copie/ml，检测范围为5. 00E+01~5. 00E+09copies/ml，为期诊断柯萨奇病CA6 型感染提供可靠的实验证据。
【主权项】
1. 一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分： RNA提取溶液、RNA洗脱液、RT-PCR增强剂、内标、PCR反应液、CA6阳性对照品、CA6阴性对照 品，其中，所述PCR反应液包括用于靶多核苷酸扩增的上游引物以及下游引物，用于靶多核 苷酸检测的探针，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针， 其喊基对序列分别为： 上游引物：5'-CTGCAGAAACGGGAGCAAG-3' ； 下游引物：5'-GAGTAAAAGTGTTCCACACTCGC-3' ； 探针 1 :5'FAM-ACCCCGTTTCGATTCATCACACA-BHQ13'。2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内标为插入PUC18T载 体的长为128碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+04copies/ml~ 5. 00E+04copies/ml;所述128碱基对的序列如下所示： 5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCGATCG CCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3' 。3. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA提取溶液包括如下组分： RNA提取溶液I:十二烷基硫酸钠，质量/体积0.2 %~1.0%、曲拉通，体积/体积 1. 0%~4. 0%，异硫氰酸胍 0· 2mol/L~1.Omol/L、100μg/ml~400μg/ml的磁珠； RNA提取溶液II:4-羟乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L~300mmol/L、pH6. 5±0. 2,氯化钠 100mmol/L~300mmol/L； RNA提取溶液III:曲拉通，体积/体积0. 1 %~1. 0%、氯化钠100mmol/L~300mmol/L； RNA提取溶液IV:矿物油。4. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA洗脱液为 Tris-HC10· 8mol/L~1. 2mol/L、EDTA0·lmol/L~1. 0mol/L〇5. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR增强剂为Μη(OAc) 2， 其浓度为 10Ommol/],~500mmol/L。6. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括5XPCR反 应缓冲液，〇. 2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，1U/μ1~5U/μ1TthDNA聚合酶，1U/μ1~ 5U/ylH-TaqDNA聚合酶，0.lymol/L~0. 2ymol/L用于扩增内标的上游引物以及下游 引物，0.05以!11〇1/1~0.2 4111〇1/1用于检测内标的探针。7. 根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增内标的上游引物以 及下游引物以及用于检测内标的探针，其碱基对序列分别为： 上游引物：5'-GCTCGATCCCGGTAACTACCA-3' ； 下游引物：5'-GTACGTGGAAACTTTTGGACG-3' ； 探针：5'HEX-TCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACC-BHQ13'。8. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CA6阳性对照品为CA6病毒基 因体外转录RNA，其浓度为1. 00~5. 00E+05copies/ml。9. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CA6阴性对照品为经过灭菌处 理的生理盐水。10. 使用权利要求1-9任一项所述的检测试剂盒用于检测样本中CA6-RNA的方法，包括 如下步骤： (1) 试剂准备； 按照提取溶液1200μ1~lml/人份，CA6-内标1μ1/人份的比例，取相应量的RNA提 取溶液I及CA6-内标，充分混匀得提取试剂Ι-mix，瞬时离心后备用； 根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按照PCR反应液49μ1/人份，RT-PCR增强 剂1μ1/人份的比例，取相应量的PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混匀，得PCR-mix，瞬时 离心后备用； (2) RNA提取：磁珠法提取CA6-RNA; S01裂解病毒：准备无核酸酶的1. 5mL离心管，每管加入200μ1~lmlRNA提取溶液 1-mix，然后加入100μ1~lml待测样本，盖上管盖，震荡混匀，瞬时离心后备用； S02磁珠吸附核酸：在步骤S01瞬时离心后备用的溶液中加入50μ1~400μ1RNA提 取溶液II，震荡混匀，室温静置10~30分钟； S03去除杂质：静止结束，瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2~5分钟后缓慢 将溶液吸出弃用，保留磁珠备用； S04洗涤：在步骤S03备用的磁珠内加入400μ1~lmlRNA提取溶液III和100μ1~ 500μ1RNA提取溶液IV，震荡混匀，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上； S05静止2~5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液 体完全吸出丢弃，静置，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠保留备用； S06在步骤S05保留备用的磁珠加入10μ1~100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗 脱到管底，吸打混匀，室温静置5~30分钟后将离心管再次置于分离器上2~5分钟，然后 将洗脱下来的RNA吸至新的1. 5ml灭菌离心管中； S07根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个0. 2mLPCR反应管加入 45μlPCR-mix，并吸取步骤S06的新的灭菌离心管中已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对 照各5μ1加入PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品； (3) 荧光PCR反应和结果分析： 选择FAM通道（Reportere:FAM,Quencher:None)检测CA6 ;选择HEX或VIC通道 (Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标；利用仪器自带的软件进行自动分析或者手动 调苄基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本Ct值结果，根据各样本 Ct值大小，判断检测结果。
【专利摘要】本发明实施例公开了一种柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒，其包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、RT-PCR增强剂、内标、PCR反应液、CA6阳性对照品、CA6阴性对照品；本发明提供的柯萨奇病毒CA6型荧光定量PCR检测试剂盒仅仅能检测出CA6-RNA，而不能检测出其他病原体RNA，并且检测灵敏度、准确度和稳定性高，检测灵敏度可达50copie/ml，检测范围为5.00E+01～5.00E+09copies/ml，为早期诊断柯萨奇病CA6型感染提供可靠的实验证据。
【IPC分类】C12Q1/70, C12R1/93, C12Q1/68
【公开号】CN105349706
【申请号】CN201510920218
【发明人】戴立忠, 丁海, 周雷, 刘佳
【申请人】湖南圣湘生物科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月11日