Proton测序所获得的下机数据进行转换，使用命 令：
[0144] tmapindex-abwtsw-freference,fa
[0145] 2. 2. 2 比对
[0146] 使用公开的tmap软件进行比对，命令行如下：
[0147]tmapmapall-a2-η16 -freference,fa-rinput.bam-v-Y-u-o1stage1 map4〉output.bam
[014引 2. 2. 3读序比对率（mappingrate)统计
[0149] 对ou化ut.bam进行统计，过滤长度小于100或者大于190的读序；然后计算每个 读序的错配率，取错配率小于5%的读序进行统计，得到每个样品的读序的比对率。
[0150] 2. 3对照试验
[0151] 在基因组提取、文库构建、IonProton测序，数据分析中用分别含绵羊、鸭的肉样 为阳性对照。用不含绵羊和鸭肉成分的样品作阴性对照。
[0152] 3数据产出有效判定
[0153] 3. 1用上述方法所构建的PCR-free文库，用TheIonProton?System进行测序， 所获得的读序（reads)的信息如下：
[0154] 总读序数量为IX108至IX109,其中读长介于100 -IWbp的读序占约70-80%。 [01巧]送表明，本发明方法所构建的PCR-化ee文库不仅质量高，而且特别适合通过Ion Proton?System进行测序。
[0156] 从所获得的reads中，选取读长介于100-190bp且错配率《5%的读序，对于单 一样品，选取数量> 1X107个有效读序即可用于后续分析（选取的数量也可多至包括所有 满足上述条件的有效读序）。
[0157] 阳性对照样品根据标准曲线曲NA基因组质量含量百分比W 100%。
[0158] 阴性对照样品根据标准曲线曲NA基因组质量含量百分比<10%。
[0159] 实施例1
[0160] 样品检测试验No.1
[0161] 将羊肉和鸭肉混合的的11个样品为例，经过建库、测序后分别与两者的染色体基 因组序列比对，计算比对率（Mappingrate);
[0162] 其中，在检测前，所述样品是事先已知绵羊肉与鸭肉的混合比例但试验者未知 的样品，样品质量混合的比例为0 %、1 %、5 %、10 %、30 %、50 %、70 %、90 %、95 %、99 %、 100%。
[0163] 如下表所示。
[0164] 表4各混合样品比对结果
[0165]
[0166] 羊拟合曲线中显示的检验位点如图1所示；鸭拟合曲线中显示的检验位点如图2 所示。误差Δ分析结果如表5所示。
[0167] 表5绵羊肉和鸭肉的误差Δ分析结果 [016 引
[0169] 讨论：
[0170] 上述图表均表明了检验数据与拟合的曲线具有良好的吻合度，并且误差控制在 10%W内。曲线能够准确反应质量含量百分率和Ma卵ingrate之间的关系，可W作为检测 标准曲线。
[0171] W样本绵羊肉混合30%为例，样本与绵羊的染色体基因组比对，读序长度比对率 24%，基于图1的标准曲线或式I公式，得出绵羊肉含量为28. 5%。
[0172] 与鸭的染色体基因组比对，读序长度比对率50%，基于图2的标准曲线或式II公 式，得出鸭羊肉含量为67. 8%。
[0173] 两者的质量误差分别为约1. 5%和约2%。
[0174] 送表明，本发明方法不仅定量结果准确，而且误差较小。可W应用于一般的定量检 测。
[0175] 实施例2
[0176] 样品检测试验No. 2
[0177] 在本实施例中，检测的样品为绵羊肉与鸭肉的混合肉类样品（样品4、样品5、样品 6)，并将测序结果与鸭子、绵羊的基因组进行比对并计算比对率。其中，在检测前，所述样品 是事先已知绵羊肉与鸭肉的混合比例但试验者未知的样品。
[0178] W样本4为例，样本4与绵羊的染色体基因组比对，读序长度比对率X4a为7 %，基 于图1的标准曲线或式I公式，得出绵羊肉含量为；8%
[0179] 与鸭的染色体基因组比对，读序长度比对率X4b为63%，基于图2的标准曲线或式 II公式，得出鸭绵羊肉含量为；85%。
[0180] 所有样品4-6的定量检测结果汇总于下表。
[0181] 表6定量检测结果
[0182]
[0183] 讨论：
[0184] 将上述检测结果与各样品的实际构成进行比较，发现几乎完全一致。送表明，本发 明方法不仅非常准确。
[0185] 并且，实验结果显示，本发明所提供的送种方法检测面广，定量结果准确，误差小。
[0186] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考郝样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，送些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种测定混合肉类的定量检测方法，其特征在于，包含以下步骤： (a) 提供一待测样品； (b) 从所述样品中，提取全基因组DNA; (c) 用上一步骤的全基因组DNA，构建PCR-free文库； (d) 对上一步骤的PCR-free文库进行测序，从而获得所述待测样品的全基因组DNA读 序； (f) 将所述读序与动物全基因组DNA标准序列进行比对，从而获得匹配的读序（即比对 上的读序）； (g) 计算与所述动物物种全基因组DNA标准序列相匹配的匹配读序的碱基数总长占总 读序碱基数长度的百分比，即读序的比对率； (h) 基于所述的读序比对率，根据制作的标准曲线计算所述待测样品中各动物源性成 分的含量。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（h)中，通过与标准曲线的比较或通 过拟合公式的计算，得出所述待测样品中动物源性成分的含量。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（h)中，所述的标准曲线包括二种或 多种不同动物的全基因组DNA的"读序比对率一质量含量百分比"标准曲线。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标准曲线包括，绵羊和鸭的2种不同 动物的全基因组DNA的"读序比对率一质量含量百分比"标准曲线。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的绵羊的拟合公式如下式I所示： Y= 1. 1809X (I) 式中，Y为绵羊肉的质量百分比，按样本的总质量计算； 其中，X为混合肉样本中比对到绵羊染色体基因组的所有读长的碱基数之和/测序中 所有读长碱基数的总和； 和/或 所述的鸭肉的拟合公式如下式II所示： Y' = 1.345X' (II) 式中，Υ'为鸭肉的质量百分比，按样本的总质量计算； 其中，X'为混合肉样本中比对到鸭染色体基因组的所有读长的碱基数之和/测序中所 有读长碱基数的总和。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤（h)中，按以下判断标准确定羊肉的 含量： 当X为彡1%，羊肉的含量为0-1% ; 当X为1-10%，羊肉的含量为1-15% ; 当X为10-50 %，羊肉的含量为10-60 % ; 当X为50-80 %，羊肉的含量为50-95 % ; 当X为80-99 %，羊肉的含量为90-100 % ; 其中，X为比对到绵羊的读序的比对率； 和/或 在步骤（h)中，按以下判断标准确定鸭肉的含量： 当X'为彡1%，鸭肉的含量为0-1.5% ; 当X'为1-10%，鸭肉的含量为1-15% ; 当X'为10-50%，鸭肉的含量为10-70% ; 当X'为50-70 %，鸭肉的含量为60-95 % ; 当X'为70-99%，鸭肉的含量为90-100% ; 其中，X'为比对到鸭的读序的比对率。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品为：生的、熟制的、半熟制的、腌 制的、熏制的、冷冻和/或冷藏的肉类和/或水产样品，以及它们的组合；并且 所述的样品包含动物脏器和血制品。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还设置阳性对照组；并且， 所述阳性对照组的试验条件与测试组相同，不同点在于，所述阳性对照组中为成分已 知的单一肉类样品。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（c)中包括以下步骤： 先将所述的全基因组DNA打断为150-350bp(更佳地150-250bp)的片段，然后再构建 文库；和/或 对于所述的经处理的片段化DNA进行纯化，从而获得大小为200-300bp(较佳地 240-260bp)的DNA片段。10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（c)中，还包括在步骤（d)中，用 选自下组的测序仪器进行测序：I〇nProton?System，LifeTechnologies的proton或 PGM,IlluminaHiSeq，ABISOLiD,Roche454;较佳地，使用IonProton?System进行测序。
【专利摘要】本发明提供了一种混合肉类的定量检测方法，具体地，本发明提供了基于高通量基因组测序的绵羊肉和鸭肉混合肉类成分的定量检测方法，包括文库构建、测序、数据处理、结果判断等主要步骤。本发明提供的方法可用于高通量地定量检测多个绵羊-鸭混合肉类样品，有结果准确、检验快速、价格低廉等优点。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105368921
【申请号】CN201410422528
【发明人】曾鹏, 王磊, 刘心, 程时锋, 黄佳颖
【申请人】深圳华大基因科技有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年8月25日