r>[0194] 图5是本实施例的试剂盒检测ID肥基因G419A位点时1 %阳性对照C在采用Ct3、 Ct4对应反应体系反应后和阴性对照f在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图。 图6是本实施例的试剂盒检测ID肥基因G419A位点时0. 5%阳性对照C在采用a3、Ct4对 应反应体系反应后和阴性对照f在采用a5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图。说明 采用本实施例的试剂盒检测IDH2基因G419A位点突变情况时，阳性对照和阴性对照均判定 为有效。
[0195] 图7是本实施例的试剂盒检测ID肥基因G419A位点时18个血液DNA样本在采用 Ctl、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。依据对应的ΔCT=Ct2-Ctl的判断公式进 行判断，采用本实施例的试剂盒检测IDH2基因G419A位点突变情况时，突变情况的判定结 果与测序结果一致。
[0196] 图8是本实施例的试剂盒检测ID肥基因G515A位点时1%阳性对照d在采用Ct3、 Ct4对应反应体系扩增后和阴性对照f在采用Ct5、Ct6对应反应体系反应后的扩增曲线图。 说明采用本实施例的试剂盒检测IDH2基因G515A位点突变情况时，阳性对照和阴性对照均 判定为有效。
[0197] 图9是本实施例的试剂盒检测ID肥基因G515A位点时18个血液DNA样本在采用 Ctl、Ct2对应反应体系反应后的扩增曲线图。依据对应的ΔCT=Ct2-Ctl的判断公式进 行判断，采用本实施例的试剂盒检测ID肥基因G515A位点突变情况时，突变情况的判定结 果与测序结果一致。
[019引另外，检测IDH1基因的C394T位点和G395A位点，测序检测结果与采用本试剂盒 的检测结果完全一致。
[0199] 灵敏度分析；采用本实施例的试剂盒检测lOng/μ1的ΙΜΠ/2基因各位点野生型 质粒溶液（含0. 5%IDH1/2基因对应位点突变型质粒），均可检出，灵敏度达到0. 5%。
[0200] 重复性分析；上述检测反应均采用复孔，每次重复五次，其间的CT值相差不超过 0. 3个循环。
[0201] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的 实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可W做出其 它不同形式的变化或变动。送里无需也无法对所有的实施方式予W穷举。而送些属于本发 明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种IDH1/2基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物，其特征在于： 所述引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物； 所述质控正向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo. 1 所示的质控正向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示 的质控正向引物； 所述检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点核苷酸序列如SEQIDNo. 3所 示的检测正向引物、针对IDH1基因G395A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示的检测 正向引物、针对IDH2基因G419A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示的检测正向引物、 针对IDH2基因G515A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo. 6所示的检测正向引物； 所述通用反向引物作为检测反向引物和质控反向引物使用，包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo. 7所示的通用反向引物和针对IDH2基因G419A/ G515A位点核苷酸序列如SEQIDN0.8所示的通用反向引物； 所述探针包括针对IDH1基因C394T/G395A位点的核苷酸序列如SEQID No.9所示的 探针、针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQID No.10所示的探针和针对IDH2基因 G515A位点核苷酸序列如SEQID No.11所示的探针，所述探针序列的5'端设有一种荧光标 记，所述探针的核苷酸序列的3'端设有另一种荧光标记； 所述扩增阻断引物是针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo. 12所示的扩 增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3'端设有磷酸化修饰。2. -种IDH1/2基因突变检测体系，包括引物、探针和扩增阻断引物，其特征在于： 所述引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物； 所述质控正向引物包括针对IDH1基因C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo. 1 所示的质控正向引物和针对IDH2基因G419A/G515A位点核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示 的质控正向引物； 所述检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点核苷酸序列如SEQIDNo. 13所 示的检测正向引物、针对IDH1基因G395A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo. 14所示的检 测正向引物、针对IDH2基因G419A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo. 15所示的检测正向 引物、针对IDH2基因G515A突变位点核苷酸序列如SEQIDNo. 16所示的检测正向引物； 所述通用反向引物作为检测反向引物和质控反向引物使用，包括针对IDH1基因 C394T/G395A位点核苷酸序列如SEQIDNo. 7所示的通用反向引物和针对IDH2基因G419A/ G515A位点核苷酸序列如SEQIDN0.8所示的通用反向引物； 所述探针包括针对IDH1基因C394T/G395A位点的核苷酸序列如SEQID No.9所示的 探针、针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQID No.10所示的探针和针对IDH2基因 G515A位点核苷酸序列如SEQID No.11所示的探针，所述探针序列的5'端设有一种荧光标 记，所述探针的核苷酸序列的3'端设有另一种荧光标记； 所述扩增阻断引物是针对IDH2基因G419A位点核苷酸序列如SEQIDNo. 17所示的扩 增阻断引物，所述扩增阻断引物的核苷酸序列的3'端设有磷酸化修饰。3. 根据权利要求1或2所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述探针序列 的5'端设有FAM荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3'端设有BHQ1荧光标记。4. 根据权利要求1或2所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：还包括阳性对 照和阴性对照； 阳性对照包括含IDH1基因C394T突变型质粒的IDH1基因394位点野生型质粒溶液、 含IDH1基因G395A突变型质粒的IDH1基因395位点野生型质粒溶液、含IDH2基因G419A 突变型质粒的IDH2基因419位点野生型质粒溶液和含IDH2基因G515A突变型质粒的IDH2 基因515位点野生型质粒溶液； 所述阴性对照包括IDH1基因394/395位点野生型质粒溶液和IDH2基因419/515位点 野生型质粒溶液。5. 根据权利要求4所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述阳性对照和阴 性对照中的野生型质粒溶液的浓度为lOng/μ1，所述阳性对照中的突变型质粒在野生型质 粒溶液中的含量是1%或〇. 5%。6. 根据权利要求5所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：所述体系的体积为 10μ1或20μ1，所述质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物的终浓度为0. 4μM，所 述探针的终浓度为〇. 2~0. 4μΜ，所述扩增阻断引物的终浓度为0. 8μΜ，所述阳性对照和 阴性对照的终浓度为1~5ng/^l。7. 根据权利要求1或2所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：还包括空白对 照；所述空白对照是超纯水。8. 根据权利要求1或2所述的IDH1/2基因突变检测体系，其特征在于：还包括PCR反 应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、2. 5mM的dNTPs和5U/μ1的TaqDNA聚合酶；所述 PCR缓冲液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR缓冲 液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8. 3 ;所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP。9. 一种采用如权利要求1或2所述的检测体系的IDH1/2基因突变检测试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒，包括引物、探针和扩增阻断引物，引物包括质控正向引物、检测正向引物和通用反向引物；所述检测正向引物包括针对IDH1基因C394T突变位点的检测正向引物、针对IDH1基因G395A突变位点的检测正向引物、针对IDH2基因G419A突变位点的检测正向引物、针对IDH2基因G515A突变位点的检测正向引物；探针序列的5’端设有一种荧光标记，所述探针的核苷酸序列的3’端设有另一种荧光标记；扩增阻断引物的核苷酸序列的3’端设有磷酸化修饰。本发明的IDH1/2基因突变检测体系及其试剂盒，可对IDH1基因的C394T/G395A突变位点和IDH2基因的G419A/G515A突变位点进行检测，灵敏度高、特异性强、快捷方便。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105368924
【申请号】CN201410710286
【发明人】赵新泰, 王明, 张长顺
【申请人】上海赛安生物医药科技有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年11月29日