z, 3H)；13C NMR(101MHz，氯仿-d) 163. 1，159. 6, 152. 2, 149. 2, 146. 7, 140. 0, 133. 7, 133. 5, 129. 8, 1 19. 2, 113. 5, 113. 5, 113. 4, 113. 4, 111. 4, 111. 4, 111. 2, 111. 2, 67. 7, 47. 9, 31. 3, 19. 2, 1 3. 9;LRMS(ESI)m/z335 (M++H, 60)，357 (M++Na, 50);HRMS(ESI)C1SH21N202F 2 (M++H)计算值 335. 1571，实验值 335. 1568。
[0165]实施例26 :2, 6-二氟-3-((3' -(戊氣某）苄某）氨某）苯甲酰胺（F376)
[0166] 该化合物（0. 13g, 38%)是通过将2, 6-二氟-3-氨基苯甲酰胺（0. 17g, 1.Ommol)、 3_(戊氧基）苯甲酸（3_(pentyloxy)benzaldehyde) (0· 19g, 1.Ommol)],对甲苯横酸一水合 物（P_t〇luenesulfonicacidmonohydrate) (0· 02g, 0·llmmol)、甲醇（lOmL)和氰基硼氢化 钠（sodiumcyanoborohydride) (0. 63g,lOmmol)混合后按照上述F373的制配程序所得。1Η NMR(400MHz,丙酮-d6) 7. 37 (br.s.，1Η)，7. 24 (t,J= 7. 82Hz, 1Η)，7. 10 (br.s.，1Η)，6. 93-7 .01 (m, 2H), 6. 72-6. 85 (m, 2H), 6. 65 (dt,J= 5. 38, 9. 29Hz, 1H), 5. 54 (br.s. , 1H), 4. 42 (d,J =5. 87Hz, 2H),3. 92-4. 02 (m, 2H),1. 71-1. 82 (m, 2H),1. 34-1. 49 (m, 4H),0. 87-0. 97 (m, 3 H)；13CNMR(101MHz,Acetone) 159. 6, 141. 3, 129. 4, 119. 1, 113. 3, 112. 7, 112. 2, 110. 4, 67 .5, 46. 9, 22. 2, 13. 4；LRMS(ESI)m/z349 (M++H, 100), 371 (M++Na, 50)；HRMS(ESI)calcdfor C19H23N20 2F2(M++H) 349. 1728,实验值 349. 1739.
[0167]实施例27 :3-( (3' -(仲丁氣某）苄某）氨某）-2, 6-二氟苯甲酰胺（F377)
[0168] 该化合物（0. 12g，36% )是通过将2, 6-二氟-3-氨基苯甲酰胺 (2,6-difluor〇-3-aminobenzamide)(0.17g，1.0mmol)、3-(仲丁 氧基）苯甲 酸（3_(sec-butoxy)benzaldehyde)(0· 17g, 1.Ommol)、对甲苯横酸一水合物 (p-toluenesulfonicacidmonohydrate) (0. 02g, 0.llmmol)、甲醇（lOmL)和氰基硼氢 化钠（sodiumcyanoborohydride) (0.63g,10mmol)混合后按照上述F373的制配程序所 得。1HNMR(400MHz,氯仿-d)7.24(t，J= 8.07Hz，lH)，6.85-6.93(m，2H)，6.71-6.85(m, 3H), 6. 61 (dt,J= 5. 14, 9. 17Hz, 1H), 6. 27 (br.s. , 1H), 4. 38 (br.s. , 1H), 4. 27-4. 34 (m, 3 H) ,1.68-1. 79 (m，lH) ,1.57-1. 67 (m，lH) ,1.25-1. 31 (m，3H)，0. 97 (t，J= 7.58Hz, 3H);13C NMR(101MHz,氯仿-d) 163. 3, 158. 7, 152. 2, 149. 8, 149. 7, 149. 2, 149. 1，146. 7, 146. 6, 140 .1, 133. 7, 133. 6, 133. 6, 133. 5, 129. 8, 119. 1, 114. 8, 114. 6, 113. 5, 113. 4, 113. 4, 113. 3, 112. 9, 112. 8, 112. 6, 111. 4, 111. 4, 111. 2, 111. 1, 75. 0, 47. 9, 29. 2, 19. 2, 9. 8 ；LRMS(ESI) 111/2335(]\1++!1，40)，357(]\1++似，40) ;!1冊5出51)(：18!121队02卩2(]\1 ++!1)计算值 335.1571，实验值 335.1580。
[0169]实施例28 :2, 6-二氟-3-((3'_((4"_ (三氟甲某）苄某）氣）苄某）氨某）苯甲 酰胺（F378)
[0170]该化合物（0· 16g，37% )是通过将2, 6-二氟-3-氨基苯甲酰胺（0· 17g，1.Ommol)、 3-((4-(三氟甲基）苄基）氧）苯甲酸（3-( (4-(trifluoromethyl)benzyl)oxy) benzaldehyde) (0. 28g, 1.Ommol)、对甲苯横酸一水合物（p-toluenesulfonic acidmonohydrate)(0· 〇2g, 0·llmmol)、甲醇（lOmL)和氰基硼氢化钠（sodium cyanoborohydride) (0. 63g,lOmmol)混合后按照上述F373的制配程序所得。1Η NMR(400MHz,氯仿-d) 7.66 (d,J=8.31Hz, 2Η), 7.56 (d,J=7.82Hz, 2Η), 7.29 (d，J =6. 85Hz, 1H)，6. 94-7. 03 (m, 2H)，6. 88-6. 93 (m, 1H)，6. 72-6. 83 (m, 1H)，6. 62 (td，J =4. 59, 8. 93Hz, 1H),6. 25 (br.s.,1H),6. 09 (br.s.,1H),5. 13 (s, 2H),4. 36 (s, 3H)；13C NMR(101MHz，氯仿-d) 158. 9, 141. 0, 140. 3, 130. 0, 127. 4, 125. 6, 125. 5, 125. 5, 120. 0, 1 13. 7, 113. 6, 111. 4, 69. 1, 47. 8；LRMS(ESI)m/z437 (M++H, 56), 459 (M++Na, 50) ；HRMS(ESI) 具02F5(M++H)计算值 437. 1288,实验值 437. 1292。
[0171] 本发明的衍生物进行如下生物测试：
[0172](A)菌株和细朐株
[0173] 微生物敏感性试验中使用的菌株是大肠杆菌，金黄葡萄球菌29213和枯草杆菌 168。其中，大肠杆菌和金黄葡萄球菌29213是通过香港理工大学的实验室获得，枯草杆菌 168购自美国标准菌库。哺乳动物细胞株L929 (小鼠腹膜成纤维细胞）、LCC6 ( -种原株乳 腺癌细胞）、LCC6MDR(P-gp高表达乳腺癌细胞株）是从理工大学的库存中获得。营养琼脂 (NutrientAgar)、胰蛋白胨（tryptone)和酵母提取物购自OxoidLimited公司（加拿大 安大略省尼平）。LB液体培养基（Luria-Bertani)通过将2g胰蛋白胨、lg酵母提取物和 2g氯化钠溶入200ml去离子水杀菌后获得。用于微生物敏感性试验的Miiller-Hinton液体 培养基（MHB)、正离子调节MUller-Hinton液体培养基（MHB)和胰酶解酪蛋白大豆培养基 (TSB)购自美国BD公司（美国新泽西州）。需用酶标仪（Bio-RadLaboratories公司680 型）测量细菌生长和细胞毒性。使用奥林巴斯FSXiO(Kf生物成像导航显微镜观察枯草杆 菌细胞。
[0174] (B)抗菌敏感件试骀
[0175] 每种化合物的最小抑菌浓度（MIC)是依据美国国家临床实验室标准化委员会 (CLSI)标准通过微量液体稀释法测定的。所有化合物在二甲基亚砜（DMS0)溶解，以双倍 稀释。将TSB琼脂板的单菌落菌株溶入5mLMHB或CA-MHB。菌细胞在37°C下进行培养，直 至生长细胞的最适密度（〇D_)达到1.0。然后将其稀释到最终浓度约为5xl05CFU/mL，在 96-微量滴定板（日本易威奇公司）双倍稀释。化合物3和PC190723用作阳性对照。在 37°C下培养18小时后，使用酶标仪测量0D6。。值，计算抑菌浓度百分比。如果MIC值等于或 高于90%，该化合物应测定为活性，是指该化合物造成的抑制细菌生长比例高于90%。表 1对所有合成化合物的MIC进行了概述。
[0176] 表1.每种化合物对不同菌株的MIC值
[0177]
[0179] (C)细朐毒件试骀
[0180] 细胞毒性试验中使用的细胞株是从理工大学的库存中取得的。在本试验中，将 小鼠成纤维细胞（L929)、一种原株乳腺癌细胞线（LCC6)和P-gp-高表达乳腺癌细胞株 (LCC6MDR)与各种浓度化合物混合，在96-微量滴定板的最终容积达到100μL。细胞在37°C 下培养3天。化合物的最大半数抑制值（IC5。）的确定是通过CellTiter96AQueous单溶液 细胞增殖检测试剂盒（普洛麦格）。3-(4, 5-二甲基噻唑-2-氧基）-5-(3-羧基-甲氧基 苯基）-2- (4_横苯基）-2H-四唑（3_ (4, 5-Dimethylthiazol_2-yl) _5_ (3-carboxy-methoxy phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H_tetrazolium) (2mg/mL，MTS,普洛麦格）和吩嗪硫酸甲酯 (phenzainemethosulfate)(0.92mg/mLPMS,西格玛奥德里奇）以 20:1 的比例混合。将 MTS/PMS混合液（10μL)加入每个井洞，在滴定板上培养2小时，温度为37°C。然后用酶标 仪（Bio-Rad)测试490nm吸光度。IC5。值通过使用GraphPad(Prism4. 0)绘图软件进行计 算。每种化合物的选择性指标通过L929毒性等级和金黄葡萄球菌29213的MIC值的比率 计算。如果选择性指标大于10,化合物定义为潜在抗生素。F332和F361被选作测试三种 哺乳动物细胞株。结果如表2所示。
[0181] 表2.F332和F361对不同哺乳动物细胞株的IC5。值。
[0182]
[0183] (D)对枯草杆菌细朐形杰的影响
[0184] 作为最有潜力的两种化合物，选择测试F332和F361对枯草杆菌168细胞形态的 影响。使用两种化合物对枯草杆菌进行对数期培育测试，使终浓度达到MIC半数值。使用 1%DMS0溶液进行控制。结果显示，两种化合物能使枯草杆菌细胞产生丝状形态。如图6所 示，枯草杆菌细胞的平均长度为3. 5±0. 7μm。如图7所示，F332使枯草杆菌细胞长度延长 三倍。F332使枯草杆菌细胞的平均长度从3. 5±0. 7μπι延长至11.7±4. 5μπι。另一方面， 如图8所示，F361使枯草杆菌细胞长度延长六倍，从3. 5±0. 7μm延长至21. 1 ± 1. 8μm。 研究发现，F332和F361能使枯草杆菌168细胞在亚致死浓度下产生丝状形态。结果显示， 两种化合物都可以通过阻塞胞质细胞分裂蛋白质从而抑制细菌繁殖。
[0185](E)荧光显微镜分折
[0186] 通过使用绿荧光蛋白标识的细胞分裂蛋白FtsZ对F332在枯草杆菌中所产生的成 丝作用在荧光显微镜下进行定位分折以。一种FtsZ-eGFP融合蛋白表达质粒的建构如下 (质粒结构示于图10a):
[0187] 根据一个革兰氏阳性菌（G+)的质粒pGK12的DNA序列，设计引物对：
[0188]序列 1 5' -TTTCCCTCTAGACCGGCAATAGTTACCCTTATT-3'
[0189]序列 2 5' -TGACAGAGATCTCATTTTGTTTATTGCAATTG-3，
[0190] 扩增PCR片断，长约4, 000个碱基对，内含氯霉素抗性基因、G+复制原点和大部分 pGK12序列。
[0191] 为了引入革兰氏阴性菌（G-)的复制原点及使氯霉素抗性基因能在大肠杆菌有效 表达，根据G-质粒pRSET-A(Invitrogen公司）的DNA序列，设计引物对：序列3 5 '-AAAAT GAGATCTCTGTCAGACCAAGTTTACTC-3 '
[0192]序列 4 5, -TGCCGGTCTAGAGGGAAACCGTTGTGGTCT-3，
[0193] 扩增长约1，000个碱基对的PCR片断，内含pBR322的复制原点和T7启动子。两 个PCR片断经限制性内切酶Xbal和Bglll消化后连接并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)，在氯 霉素平板上进行筛选，获得质粒pFZl. 0。
[0194] 通过引入乳糖操纵子机制，可有效地控制枯草杆菌FtsZ基因的过量表达所引起 宿主的致死效应。根据pFZl. 0的DNA序列，设计引物对：
[0195]序列 5 5, -AAGTAAGAATTCTGCTAGCAGAAGCTTCG-3'
[0196]序列 6 5' -GGGGCACTCGAGGGGTTAGTGACATTAGAAAAC-3'
[0197] 扩增PCR片断，长约3, 800个碱基对，去除多余的pGK12部分。
[0198] 根据pMAL_c2 (NEB公司）的DNA序列，设计引物对：
[0199]序列 7 5, -ATCCTACTCGAGTGCCCCGTTAGTTGAAGAAG-3，
[0200] 序列 8 5, -TAGCATGAATTCAAACGATCCCGCGAAATTAATAC-3，
[0201] 扩增长约1，200个碱基对的PCR片断，内含lacA基因及其lacl启动子。两个PCR 片断经限制性内切酶Xhol和EcoRI消化后连接并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)，在氯霉素平 板上进行筛选，获得质粒pFZl. 1。
[0202] 根据pFZ1 · 1的DNA序列，设计引物对：
[0203]序列 9 5, -AAGTAAGAATTCTGCTAGCAGAAGCTTCG-3'
[0204]序列 10 5, -AGATCTGGATCCAAACGATCCCGCGAAATTAATAC-3，
[0205] 扩增PCR片断，长约5, 000个碱基对，用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行消化。 再根据G+载体pHT43 (MoBiTec公司）的DNA序列，设计引物对：
[0206]序列 11 5, -GGATCCAGATCTGAATATTTCAGCTTGGTTTTCC-3，
[0207]序列 12 5, -AGCTAAGAATTCGCTACGATGGATCCTTCCTCCTTTAATTGG-3'
[0208] 扩增长约450个碱基对的PCR片断，内含groE启动子和lacO序列，用限制性内切 酶EcoRI和Bglll进行消化。两个片断连接后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)，在氯霉素平板上 进行筛选，获得质粒PFZ2. 0。
[0209] 根据枯草杆菌168的FtsZ基因序列，设计引物对：
[0210] 序列 13 5, -GAGGAAGGATCCATGTTGGAGTTCGAAACAAAC-3，
[0211] 序列 14 5, -ACTGCCCGAACCGCTTCCGCCGCGTTTATTACGG-3'
[0212] 扩增PCR片断，长约1，200个碱基对。
[0213] 此外根据pEGFP的DNA序列，设计引物对：
[0214]序列 15 5, -GGAAGCGGTTCGGGCAGTATGGTGAGCAAGGGCGA-3，
[0215]序列 I6 5, -CTAGCAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，
[0216] 扩增长约700个碱基对的eGFP基因片断，通过重叠延伸PCR方法连接两个片断， 再用内切酶EcoRI和BamHI消化并连接到pFZ2. 0的对应内切位点上，转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)，在氯霉素平板上进行筛选，获得质粒pFZ-FtsZ-eGFP。提取质粒转化到枯草杆菌 168,在含氯霉素的LB培养液内生长，加入不同浓度的乳糖或IPTG观察FtsZ-eGFP基因的 表达。
[0217] 图10b和10c所示的枯草杆菌是在没有F332的情况下培养，在荧光显微镜下图 l〇b的枯草杆菌细胞中间部分出现了较强的绿色荧光，表示FtsZ-eGFP融合蛋白的表达质 粒被定位并整合于细胞中间以形成细胞分裂的z环（z-ring)。
[0218] 图10d和10e所示的枯草杆菌是在F332的情况下培养，在荧光显微镜下图10d的 枯草杆菌细胞多个部分出现了绿色荧光，并使细胞增长，反映FtsZ-eGFP融合蛋白的表达 质粒在细胞中的定位被F332影响。因此，该蛋白的表达不只于在进行细胞分裂的位置。
[0219](F)金黄葡萄球菌FtsZ蛋白质（S.aureusFtsZprotein)的表达矛口提纯
[0220] 携带金黄葡萄球菌ftsz基因的大肠杆菌BL21细胞是从理工大学实验室菌库 中获得的。将菌库中提取的大肠杆菌菌株在5mLLB培养液和100yg/mL氨苄青霉素 (ampicillin)中培养14-16小时，温度为37°C。隔夜培养的细胞培养液（2mL)转至200mL 的2XTY培养液中，其中含100μg/mL氨苄青霉素，使细胞在37°C下生长，直至光学吸收率 (〇D6。。）达到0. 8。蛋白质表达在添加0. 4mM异丙基-β-D-l-硫代半乳糖苷（isopropyl-β -D-l-thiogalactopyranoside) (IPTG)后再过4小时被诱发。细菌细胞在20分钟9000rpm 离心分离力作用下得以聚集，温度为4°C。然后细胞团块在20mL起始缓冲液（0.02M磷酸 钠，0. 5M氯化钠，pH7. 4)中再次悬浮。通过声波降解法将细胞均质化，增幅为50 %，30秒 带脉冲，30秒无脉冲，进行5个循环。不能溶解的细胞残骸在1. 5小时13,OOOrpm离心分离 力作用下排除，温度为4°C。浮层通过0. 22μm无菌过滤器进行收集和过滤。
[0221] 浮层中的FtsZ蛋白质通过快速蛋白质液相层析法（FastProteinLiquid Chromatography(FPLC))进行提纯。在FPLC