采用3,5_二硝基水杨酸法(DNS法)测定果糖基转移酶活力和薄层层析法(TLC 法)定性分析合成低聚果糖的含量。
[0055]DNS法实验方法如下：收集上述丝状真菌的新鲜孢子，计数后取适量接种至150ml发酵培养基中（500ml锥形瓶），使得孢子终浓度为1X106个/mL，28°C，180rpm培养48h，抽滤 收集菌丝，用去离子水洗涤后滤干，称取0.02克菌丝体与2ml25 % (W/V)蔗糖溶液（用 0.1mol/LpH5.0的柠檬酸磷酸缓冲溶液配制)和2mlpH5.0的磷酸缓冲液混合，50°C反应2 小时，沸水浴5min终止反应，上述反应后上清糖液适当稀释，取lml加入酶标管中，再加入 DNS2ml，煮沸2min，冷水冷却，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，540nm测0D值。空白对照是直接 取lml蒸馏水与2mlDNS混匀进行同样实验条件操作。
[0056]酶活定义:催化底物鹿糖每分钟反应产生Ιμπιο?的还原糖所需的酶量定为一个酶 活力单位。
[0057] 其中上述发酵培养基配方：蔗糖30g/L，酵母膏3g/L，NaN03 5g/L，K2HP〇4 0.5g/L，MgS〇4 7H20 0.5g/L，FeS〇4 0.01g/L，CuS〇4 0.01g/L。
[0058]其中上述葡萄糖标准曲线的制备采用相同的还原糖测定体系，标准曲线葡萄糖浓 度在lg/L-lOg/L之内，葡萄糖标准曲线如图8。
[0059]TLC法操作如下：取上述反应2h后的上清糖液，稀释20倍取ΙμL点样于铝箱层析硅 胶板上，吹干水分，在经展开剂饱和的层析缸中层析，流动相流动至铝箱层析硅胶板前沿 lcm处时，取出层析板吹干溶剂，侵入显色剂，在105°C干燥显色。根据显色后条带的位置和 大小确定糖成分和含量。
[0060]上述铝箱层析硅胶板型号是GF254,购自鼎国生物科技有限公司。
[0061 ] 上述展开剂组成:正丁醇:异丙醇：乙酸:水(V:V:V:V)=7:5:2:4。
[0062] 上述显色剂组成：（苯胺-二苯胺-磷酸试剂）0.4mL苯胺、0.4g二苯胺、2mL85%的 磷酸、20mL丙酮（当天配制使用）。
[0063] 经DNS法测定和TLC分析，结果表明所鉴定的产红色晕圈直径大于标准菌株的诱变 株具有较高的果糖基转移酶活力，如诱变株A11，发酵48h果糖基转移酶酶活达481U/g，是标 准菌株(314U/g)的1.5倍(见图6)，转化产物中蔗糖含量减少，生成的低聚果糖含量明显增 加(见图7);鉴定的产红色晕圈直径小于标准菌株的诱变株发酵48h果糖基转移酶酶活力和 合成低聚果糖含量明显较低。
[0064] 上述DNS法测定和TLC分析结果与平板显色检测结果相一致，进一步证明了本发明 方法效果真实和确定性。
[0065]实施例4.快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法的应用 [0066]从山东星光糖业集团有限公司糖厂内的土壤中筛得5株丝状真菌，经形态学和分 子生物学鉴定知，2株是塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)，编号T1、T2;3株是棘孢曲霉 (Aspergillusaculeatus)，编号J1、J2和J3。采用本发明所述方法对该5株丝状真菌合成低 聚果糖的能力进行检测。
[0067]操作方法如下：
[0068] (1)分别收集5株丝状真菌的新鲜孢子制得浓度为IX 107个/mL的孢子悬液，同时， 将工业用黑曲霉XG530菌株作为本检测丝状真菌合成低聚果糖能力平板显色方法的标准菌 株，以相同实验条件制备孢子悬液;分别取ΙμL孢子悬液点种于察氏固体培养基的平板上， 其中各菌株孢子之间点种距离不小于2cm，30°C培养5小时。
[0069] (2)配制葡萄糖检测液，直接倒在步骤（1)培养后的生长有菌落的平板上，并使其 均匀覆盖平板上的所有培养基表面，然后在40°C下静置lOmin。
[0070] 实验结果见图8,棘孢曲霉J1产生直径为1.2cm的红色晕圈，显著大于标准菌株，鉴 定棘孢曲霉J1是合成低聚果糖能力较强的丝状真菌;塔宾曲霉T1、T2和棘孢曲霉J3产生直 径为lcm的红色晕圈，鉴定低聚果糖合成能力较标准菌株强但相对棘孢曲霉J1弱;棘孢曲霉 J2产生的红色晕圈直径大小与标准菌株相当，但晕圈颜色明显较弱，鉴定棘孢曲霉J2合成 低聚果糖能力较弱。如此，利用本发明所述的平板显色方法，可实现对丝状真菌合成低聚果 糖能力的进行快速鉴定。
【主权项】
1. 一种快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法，步骤是： (1) 将待测的丝状真菌新鲜孢子分别用无菌生理盐水稀释至1X1〇7~1〇8个/mL，制得丝 状真菌孢子悬液备用；其中所述丝状真菌是：黑曲霉（Aspergillusniger)、塔宾曲霉 (Aspergillustubingensis)和/或棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus);同时，将工业用黑 曲霉XG530菌株作为本检测丝状真菌合成低聚果糖能力平板显色方法的标准菌株，以相同 实验条件制备孢子悬液备用； (2) 分别取步骤（1)制备的丝状真菌孢子悬液及标准菌株孢子悬液ΙμL，点种于察氏固 体培养基的平板上，其中各菌株孢子之间点种距离不小于2cm，在30±3°C培养5~10小时； (3) 配制葡萄糖检测液，直接倒在步骤(2)培养后的长有菌落的平板上，并使其均匀覆 盖平板上的所有培养基表面，然后40±5°C静置10~20min，观察菌落周围形成的红色晕圈， 比较待测菌株与标准菌株形成的红色晕圈的大小，若红色晕圈比标准菌株形成的大即可判 定该待测菌株合成低聚果糖能力强，若红色晕圈比标准菌株形成的小即可判定该待测菌株 合成低聚果糖能力弱;其中，所述葡萄糖检测液的配方是:葡萄糖氧化酶(G0D)4~6U/ml，过 氧化物酶（P0D)0.2~0.4U/ml，4-氨基安替吡啉（4-AAP)0.1mg/ml，苯酚lmg/ml，琼脂粉 0.007g/ml〇2. 根据权利要求1所述快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法，其特征 在于，步骤(1)所述丝状真菌孢子悬液浓度为1X1 〇7个/mL。3. 根据权利要求1所述快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法，其特征 在于，步骤(2)所述培养温度为30°C，培养时间为5小时。4. 根据权利要求1所述快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法，其特征 在于，步骤(3)所述葡萄糖检测液的配方是：葡萄糖氧化酶(GOD)5U/ml，过氧化物酶(POD) 0 · 3U/ml，4-氨基安替吡啉(4-AAP)0 ·lmg/ml，苯酚lmg/ml，琼脂粉0 · 007g/ml。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测丝状真菌合成低聚果糖能力的平板显色方法，是将待测的丝状真菌和标准菌的新鲜孢子悬液点种于察氏固体培养基的平板上，各菌株孢子之间点种距离不小于2cm，30℃培养5h，将葡萄糖检测液直接倒在以上长有菌落的平板上，并使其均匀覆盖平板上的所有培养基表面，40℃静置10min，观察菌落周围形成的红色晕圈，比较待测菌株与标准菌株形成的红色晕圈的大小，若红色晕圈比标准菌株形成的大即可判定该待测菌株合成低聚果糖能力强，若红色晕圈比标准菌株形成的小即可判定该待测菌株合成低聚果糖能力弱。本发明方法操作简单，成本低廉，是一种简便、高效、可靠的适用于鉴定丝状真菌合成低聚果糖能力的方法，具有工业应用价值，值得推广。
【IPC分类】C12Q1/54, C12Q1/26, C12Q1/28
【公开号】CN105463062
【申请号】CN201610040343
【发明人】钟耀华, 张静, 李宁, 谢益佳, 宁占国, 周焕霞
【申请人】山东大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月21日