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【发明内容】
[0049] 本发明的目的是为动物生产和工业生产提供一种藏猪源解淀粉芽孢杆菌，该菌株 是从藏猪肠道内容物中分离出的能够分解纤维素的芽孢杆菌。经鉴定，该芽孢杆菌是一种 新的藏猪源解淀粉芽孢杆菌，将其分类命名为解淀粉芽孢杆菌BY-5( Bacillus amyloliquefaciens)，已送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国.武汉.武汉大 学;保藏日期：2013年12月31日；保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2013739,该菌株可用于纤维素酶 的提取，以利于工业开发;或在动物生产中用于制作促进猪等单胃动物消化粗纤维的微生 态制剂，如:生囷等。
[0050] 所述的藏猪源解淀粉芽孢杆菌的16SrRNA基因序列如SEQ ID N0:1所示。所述的藏 猪源解淀粉芽孢杆菌所克隆的内切纤维素酶基因的序列如SEQ ID N0:2所示。克隆解淀粉 芽孢杆菌BY-5(Bacillus amyloliquefaciens)纤维素酶基因，并在原核表达系统中进行了 表达。用DNAssist分析软件对纤维素酶基因 bglc-BY所编码的499个编码氨基酸序列分析发 现，该氨基酸序列由糖基水解酶家族5中的一个纤维素酶和N末端的纤维素绑定区域(CBM-3)组成，且编码的蛋白属于BglC的家族。此外，还发现该纤维素酶蛋白由20种氨基酸组成， 所编码蛋白的分子量理论值为55KD，等电点为8.6。
[0051] 所述的藏猪源解淀粉芽孢杆菌用于制备微生态制剂的应用。所述的藏猪源解淀粉 芽孢杆菌用于纤维素酶提取的应用。所述的藏猪源解淀粉芽孢杆菌用于纤维降解的应用。 本发明的藏猪源解淀粉芽孢杆菌有较高的纤维素酶活性，可用于肠道中或粪便中纤维素的 降解，改善养殖场动物生存环境；同时，在体外模拟胃肠道的实验中，其具有强的抗逆特 性，也可用于研发微生物制剂，以防治动物肠道疾病的发生。
[0052] 藏猪源解淀粉芽孢杆菌对热、人工胃液、人工肠液(不同胆盐浓度)有强的耐受性， 且对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用，对猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02的毒性小;但该菌对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌对细胞的黏附有一定的 抑制作用。
[0053]本发明的藏猪源解淀粉芽孢杆菌是从藏猪肠内容物中经分离、筛选获得，与现有 技术相比，具有以下优点：
[0054] 1)藏猪源解淀粉芽孢杆菌BY_5(Bacillus amyloliquefaciens)是从藏猪肠内容 物中筛选出的纯天然菌种，其发酵上清液具有很高的纤维素酶活性，并且具有强的抗逆特 性、细胞毒性小。因此，可以直接用于益生菌的开发、粪肥腐熟处理、纤维素酶提取、粗纤维 降解等。
[0055] 2)从藏猪源解淀粉芽孢杆菌BY-5(Bacillus amyloliquefaciens)基因组DNA中克 隆的纤维素酶基因 bglc-BY基因能够在pET原核表达系统中进行外源表达。
【附图说明】
[0056] 图1纤维素分解菌在CMC-Na板上的水解圈；
[0057] 图2纤维素分解菌的形态特点；
[0058]图3纤维素分解菌的革兰氏染色；
[0059]图4纤维素分解菌的芽孢染色；
[0060]图5纤维素分解菌的16S rRNA基因的琼脂糖凝胶电泳图，该图中:Μ为Marker III， 泳道1，2为纤维素分解菌的16S rRNA基因条带；
[0061 ]图6纤维素分解菌Bacillus amyloliquefaciens BY-5的 16S rRNA基因系统发育 树；
[0062]图7纤维素分解菌Bacillus amyloliquefaciens BY-5生长曲线；
[0063]图8葡萄糖标准曲线；
[0064] 图9纤维素分解菌Bacillus amyloliquefaciens BY-5的产酶能力；
[0065] 图 10 Bacillus amyloliquefaciens BY-5纤维素酶基因 bglc-BY的琼脂糖凝胶电 泳图，图中:Μ为Marker III，泳道1，2为bg 1 c-BY基因条带，大小为1500bp;
[0066 ]图11纤维素内切酶基因 bg 1 c-BY序列进化树；
[0067] 图12纤维内切酶蛋白氨基酸的序列分析；
[0068] 图13纤维素内切酶蛋白的结构预测；
[0069]图14纤维素酶基因 pET28(a + )-bglc-BY表达载体的酶切鉴定；该图中：M为 markerlll，泳道1为pET-bglc-BY表达载体的双酶切片段，泳道2为pET-bglc-BY表达载体的 单酶切片段；
[0070] 图15重组菌株pET-bglc-BL21在原核细胞中的表达，有透明圈的为重组菌株pET-bglc-BL21，没有透明圈的为空载体pET-BL21对照；
[0071] 图16为BY-5的耐热性结果曲线图；
[0072]图17为BY-5的耐人工胃液能力曲线图；
[0073]图18为BY-5的耐胆盐能力曲线图；
[0074] 图19为BY-5对致病菌的抑菌试验。图A为大肠杆菌，B为沙门氏菌，C为金黄色葡萄 球菌；
[0075] 以下结合附图和具体试验及对本发明作进一步的详细说明。
【具体实施方式】
[0076] 微生态制剂，是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制 剂。也就是说，一切能促进正常微生物群生长繁殖的及抑制致病菌生长繁殖的制剂都称为 微生态制剂。因其调节肠道的功效快速，并构建肠道微生态平衡，无论在婴儿，老人，还是新 生畜禽都可防止和治疗腹泻、便秘。现常用的人用微生态制剂有生态活菌素、妈咪爱、奘灵 水苏糖、整肠生、米雅等。
[0077] 本发明的芽孢杆菌属细菌-解淀粉芽孢杆菌B Y - 5 ( B a c i 1 1 u s amyloliquefaciens)，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为:CCTCC Ν0:Μ 2013739。该解 淀粉芽孢杆菌从藏猪盲肠、小肠或胃的内容物中都能分离所得，能够产生纤维素酶，具有降 解羧甲基纤维素钠的能力。在37°C，220rpm条件下进行产酶发酵培养，结果显示，菌株在发 酵培养至28~44h时产纤维素酶量高且稳定。
[0078] 申请人以NCBI上所发布的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens subsp · plantarum str · FZB42)的纤维素酶基因 bglc为依据，利用primer primer5 · 0设计引 物进行PCR扩增，成功扩增出了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus &11171〇119116€3(^6118)13￥-5的内 切纤维素酶β_1，4葡聚糖酶基因 bglc-BY，并成功构建了纤维素内切酶基因 bglc-BY原核表 达系统，于37°C、220rpm、菌液0D600达到0.8左右时，进行IPTG诱导，结果显示，所构建的原 核表达系统在体外表达成功。
[0079] 本发明的芽孢杆菌属细菌-解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BY_5 经过体外益生评定显示，该菌株具有强的耐热、耐酸和耐胆盐能力，此外，对致病菌具有一 定的抑制以及黏附抑制作用。
[0080] 由以上结果看出，从藏猪肠道中分离筛选的纤维素分解菌-解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)BY_5能够用来发酵生产纤维素酶以及猪源益生菌的开发， 对大力发展健康、节粮性养猪业具有重要意义和广泛应用前景。
[0081 ]以下通过申请人给出的实施例进行详细说明。
[0082] 实施例1:ΒΥ-5的分离筛选
[0083] 1.1试验材料来源及采集
[0084] 藏猪肠道内容物样品采集于杨凌华益实业有限公司藏猪屠宰场，试验猪均为8月 龄健康猪，其饲养管理条件一致，日粮组成含有90%的青粗饲料，另外添加10%左右的豆渣 和麸皮等。藏猪在屠宰后剖开腹腔，迅速分离胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠，且每段各取 20cm左右，并在肠管两端用线绳结扎、剪断，装封口塑料袋中排气封口，放入冰盒迅速带回 实验室，并放入4°C冰箱，在短时间内尽快进行纤维素分解菌的分离。
[0085] 1.2菌株的分离筛选
[0086] 1.2.1培养基的配置
[0087] 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)筛选培养基(g/L) :CMC_Na 10g，蛋白胨5g，酵母粉0.5g， K2HP〇4l · 5g，MgS〇4.7H20 0 · 2g，氯化钠5g，琼脂粉15g，蒸馏水定容到1L〇
[0088] 基础摇瓶发酵培养基:普通液体LB培养基中加入1 %的CMC。
[0089] LB培养基:胰蛋白提取物10g;酵母提取物5g;氯化钠5g;蒸馏水定容到1L。
[0090]以上培