化q DNA聚合酶、Phusion聚合酶、 OneTaq?热启动DNA聚合酶、OneTaq?DNA聚合酶、Vent;民⑧DNA聚合酶、VentR( exo-) DNA聚合酶、Deep VentR?DNA聚合酶、De邱 VentR(ex〇-)DNA聚合酶等；
[0038] 上述步骤7)中，PCR体系纯化方式不限于胶回收和磁珠纯化等方式进行DNA片段大 小的筛选；
[0039] 上述步骤7)中，高通量测序平台包括但不局限于IlIumina公司的化seq、Miseq、 NextSeq等测序平台；Ion proton的PGM平台；Roche454的GS JuniorW及GS 化X+平台等；
[0040] 数据分析方法无限制。
[0041] 发明的有益效果
[0042] 本发明的技术与现有技术相比，本技术采用多步PCR的方法直接富集微量DNA序列 中甲基化CpG岛序列W对待测目的片段进行高通量测序，具有很高的DNA序列针对性，效率 极高，避免了在测序过程中的出现数据浪费现象;并且可W直接对极微量DNA来源进行捕捉 富集并建立DNA文库，准确性高，极大的扩展了甲基化测序的应用范围，比如血液、体液W及 尿液中的微量DNA序列的高通量测序。
[0043] 与现有技术相比，本技术在PCR过程中采用了单链剪切的核酸外切酶去除多次直 接PCR体系中的引物，极大的降低了反应体系中的背景；
[0044] 与现有技术相比，本技术步骤2到步骤6中PCR技术可W在单管连续进行，避免了中 间纯化步骤的浪费情况，可W省时省力并且可配备使用自动化设备完成所有过程，在质量 可控的条件下，极大的优化了 DNA文库建立的复杂性，简化了生产工艺，降低了生产成本。
【具体实施方式】
[0045] W下说明本发明的【具体实施方式】。
[0046] 实施例1:血浆循环游离DNA中甲基化CpG岛高通量测序文库的建立。
[0047] 使用抓TA抗凝的抽血管从人体中抽取1~10毫升的人体血液，在4度经过两轮 1350g的离屯、，离屯、时间12分钟，离屯、后分别取出上层液体，最后再使用13500g高速离屯、，离 屯、时间12分钟，彻底去除血浆中可能存在的血细胞。紧接着使用商品化的试剂盒幻mo EZ Methylation-Direct Kit从血浆中提取循环游离DNA并用适当的体积(20微升)洗脱，DNA总 量为1~IOng JOOngW下的样品量都可W称之为微量。紧接着使用商品化的亚硫酸盐试剂 盒对该DNA体系进行亚硫酸盐化处理，使DNA中没有进行5位修饰的胞喀晚转化为尿喀晚而 保留DNA序列中5位甲基修饰的胞喀晚，最终将转化后的样品洗脱至10.25微升体系。
[0048] 该转化过的DNA样品先使用含有引物A的PCR体系，PCR体系共15微升。进行第一轮 PCR线性扩增后使用核酸外切酶1(0.5微升，30分钟)将体系中的过量引物A消化掉;反应结 束后在高溫条件下(80°C，20分钟)使得核酸外切酶I失活进而避免该酶对后续反应的干扰。 紧接着在反应管中直接多步加入含有引物B的PCR反应体系(共计20微升），使之在PCR仪器 中进行第二轮线性扩增。获得的样品管中直接加入第=步含有接头引物C和接头引物D的 PCR反应体系(体积共50微升)在PCR仪器中进行指数扩增18至22个循环。最终PCR管样品吸 取45微升体系使用商品化磁珠进行尺寸选择的多步纯化进而获得尺寸为IWbp~300bp的 DNA文库。将获得的DNA文库经过质检后送测高通量测序并最终进行数据分析。
[0049] 具体将微量DNA样品进行亚硫酸盐处理W及后续建库分析的步骤如下：
[0化0] 1.1，向CT ConversionReagent管中加入790uL M-Solubilization buffer^及 300uL M-DiIutionBuffer;在室溫条件下用剧烈震荡15s混匀样品，并且使用DNA旋转混合 仪混匀IOmin;
[0化1] 1.2,向体系中再加入160uL M-Reaction Buffer,并再多混Imin(溶液配好后是透 明状态，但是稍微有点沉淀）；
[0052] 1.3,取20uL的CfDNA样品（体积不够用水补足)置于1.5mL低吸附离屯、管中，然后向 管中中加入130uL CT Conversion Reagent用移液器吹打混匀后分装到PCR管中。
[0053] 1.4，将PCR管放在PCR热循环仪上并按照下面的热循环进行前期反应:98°C，8min; 64°C，3.5h;4°C，保溫；
[0054] 1.5,将600uL !-Binding Buffer加入到Zymo-SpinTM IC Column中，加入IuL (Airier RNA并将Column放入到Collection l\ibe中；
[0化5] 1.6,将从第二步中取出的反应液加入到含有M-Binding Buffer的Column中，盖上 Column的盖子并颠倒6次；
[0化6] 1.7，将Column放在离屯、机上用1000 Og离屯、30s，并吸取滤过液丢弃；
[0化7] 1.8,向Column中加入IOOuL M-Wash Buffer,在使用14000巧m的离屯、力离屯、30s;
[0化引 1.9,向Colu皿中加入200uL M-Desulphonation Buffer,并让其在室溫（20。030 °C)里静置反应15~20min。紧接着使用14000巧m的离屯、力离屯、30s。
[0化9] 1.10,向Colmnn中加入200uL M-Wash Buffer,在离屯、机上用14000巧m的离屯、力上 离屯、30s;并重复加入200uL M-Wash Buffer,使用14000巧m的离屯、力离屯、60s。
[0060] 10)将Column加入到一个新的1.5血低吸附离屯、管中加入12.5uL的Low TE,室溫下 静置60s后，在1400化pm的离屯、力下离屯、60s洗脱DNA样品。
[0061 ] 步骤2,将步骤1中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中。
[0062] 将步骤1中获取的处理样品加入到含有引物A的PCR体系中（含有热启动DNA聚合 酶)并在PCR仪器中进行线性扩增。
[0063] 2.1，将步骤1中的洗脱液（11.化1，体积不足部分用面ase-free d地2〇补足）转移 至PCR管中，并按照下表格加入PCR扩增体系，该步骤在冰上操作并使用移液器混匀。
[0064]
[0065] 注:*引物A的序列为
[0066] 5'-TTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGHHHHCCGCGCG-3' 巧=A/C/T)，其浓度为 SuMo
[0067] 2.2，将PCR体系放在PCR仪器上按照下述溫度变化进行第一轮线性扩增：95 °C， 3111111(第一次）；95°(：，3〇3;50°(：，2111111;721：，1111111;4°(：，保溫；
[0068] 步骤3,将步骤2中的PCR产物中加入核酸外切酶去除体系中的单链引物；
[0069] 3.1，将样品管从PCR仪器中拿出后置于冰上；
[0070] 3.2，直接向体系中加入0.5uL的核酸外切酶I(肥B:)并吹打混匀；
[0071] 3.3，将PCR管放在PCR仪器上按照下述溫度变化进行操作：37°C，30min ; 80°C， 20min;4°C，保溫；
[0072] 步骤4,将步骤3中的酶消化产物加入到含有引物B的PCR体系中并进行线性扩增；
[0073] 4.1，将PCR样品管从PCR仪上去下后直接加入1.0化的引物B (混合物)**并吹打混 匀；
[0074] :引物B为混合物，混合引物浓度共为5. OuM，每条为1.25uM，其序列见下：
[00巧]5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD孤孤孤DGCGD-3 ' ；（ D=A/T/G)
[0076] 5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD孤孤孤GDCGD-3 ' ；（D=A/T/G)
[0077] 5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD孤孤DG孤CGD-3 ' ；（ D=A/T/G) [007引 5 ' -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGD孤孤GD孤CGD-3 ' ；（D=A/T/G)
[0079] 4.2,将PCR仪器预热到95°C，迅速将样品管插入到PCR仪器孔中持续两分钟后，迅 速将样品管取下插入冰水浴上保持3分钟；
[0080] 4.3，按照下表格配置第二轮PCR扩增混合物体系； 「mfti 1 33 入3 ? UU丄 MU i 以1、-心 >日 I干刀S/JH /、了
以1、'|下 MM 巨下刀~心、；）J 化。勺？ '1丄休 I h ;
[0083] 4.5,将PCR仪器操作孔中溫度预先预冷到4°C，将样品管放到仪器孔中。然后按照 下述溫度变化进行第二轮扩增:4°C，50s; 10 °C，Imin; 20 °C，4min; 30 °C，4min; 37 °C，4min; 75 °C，20min;4°C ,forever***;
[0084] *林:每次变溫时升溫速度为rc/s。
[0085] 步骤5，将步骤4)中的PCR产物进行磁珠纯化；
[0086] 5.1，将Beckman产品的Ampure XP磁珠从4°C取出后放置在室溫15min后，震荡混 匀；
[0087] 5.2,吸取20ul的磁珠加入到样品管中，用移液器吹打混匀，室溫条件下静置 IOmin;
[0088] 5.3,将样品管放在磁架中保持5min，待磁珠都被吸附在靠近磁架的样品管壁上； 现配80 %的乙醇溶液；
[0089] 5.4，打开样品管，用移液器吸出管中所有的液体并丢弃；
[0090] 5.5,用移液器向管中加入200ul 80%的乙醇溶液，并静置30s，吸出管中的乙醇溶 液;重复该操作，并最终用IOul移液器彻底吸出管中的液体；
[...