:22593-8;Runkel，L.等，（1993)Virology 197:529-36]。此夕h在C 末端截短的X蛋白可比全长X蛋白更具致瘤性(Tu H等.2001Cancer Res 61:7803-7810)。因 此，如果被递送至感兴趣的细胞，截短的X蛋白的表达可能会促进肿瘤发生，运妨碍了野生 型WPRE序列的安全应用。
[0049] 本文中所述的胖口36的气区"定义为，至少具有X蛋白ORF的前60个氨基酸，包括翻译 起始密码子，及其相关的启动子。本文中，"功能性"X蛋白定义为，在感兴趣的细胞中表达 时，能够促进肿瘤发生的截短的X蛋白，或一转换表型。本申请内容中，"非功能性"X蛋白定 义为，在感兴趣的细胞中无法促进肿瘤发生的X蛋白。
[0050] 本发明发明人已用间隔子或填充核巧酸序列（SNS)替换WPRE序列，并且发现，仍然 会发生高效的转录：由此，防止了由X-蛋白ORF介导的肿瘤发生的可能性。所述间隔子或填 充核巧酸序列（SNS)可W是任何序列，其有利地是非WPRE序列的随机和/或非编码的序列， 并且有利地，不包含起始密码子。优选地，所述填充序列还包含供于稀切型限制性酶的限制 性酶切位点（即，所述位点不可能存在于待分析的核巧酸中），并且所述位点不存在于文库 载体的多克隆区，W允许多个填充序列的移除。
[0051] 因此，本发明提供一种工程改造的或非天然产生的逆转录病毒载体，其包含在感 兴趣的核巧酸序列(NOI)下游插入的间隔子或填充核巧酸序列（SNS)，其中所述SNS对于所 述载体是异源的，并且不包含终止密码子，并且其中，所述载体不包含±拨鼠肝炎病毒转录 后调控元件(WPRE)。所述SNS可紧接NOI序列下游。换言之，本发明提供一种工程改造的或非 天然产生的逆转录病毒载体，其中所述WPRE已被SNS替换。
[0052] 有利的是，所述间隔子或填充核巧酸序列(SNS)是约3个核巧酸、约4个核巧酸、约5 个核巧酸、约6个核巧酸、约7个核巧酸、约8个核巧酸、约9个核巧酸、约10个核巧酸、约11个 核巧酸、约12个核巧酸、约13个核巧酸、约14个核巧酸、约15个核巧酸、约16个核巧酸、约17 个核巧酸、约18个核巧酸、约19个核巧酸、约20个核巧酸、约21个核巧酸、约22个核巧酸、约 23个核巧酸、约24个核巧酸、约25个核巧酸、约26个核巧酸、约27个核巧酸、约28个核巧酸、 约29个核巧酸、约30个核巧酸、约31个核巧酸、约32个核巧酸、约33个核巧酸、约％个核巧 酸、约35个核巧酸、约36个核巧酸、约37个核巧酸、约38个核巧酸、约39个核巧酸、约40个核 巧酸、约41个核巧酸、约42个核巧酸、约43个核巧酸、约44个核巧酸、约45个核巧酸、约46个 核巧酸、约47个核巧酸、约48个核巧酸、约49核巧酸，或约50个核巧酸。
[0053] 在另一个实施方式中，所述间隔子或填充核巧酸序列（SNS)可W是约3-50个核巧 酸、约5-45个核巧酸、约7-40个核巧酸、约10-30个核巧酸或约15-25个核巧酸。在一个特别 有利的实施方式中，所述间隔子或填充核巧酸序列（SNS)可W是约3-20个核巧酸、约3-18个 核巧酸、约3-16个核巧酸、约3-14个核巧酸、约3-12个核巧酸、约3-10个核巧酸、约3-9个核 巧酸、约3-8个核巧酸、约3-7个核巧酸或约3-5个核巧酸。所述SNS的长度可W是50-200个核 巧酸、75-175个核巧酸或100-150个核巧酸。
[0054] 优选地，该间隔子或填充核巧酸序列（SNS)少于10个核巧酸。所述间隔子或填充序 列形成本发明的另一方面。
[005日]采用病毒载体用于基因疗法的概念是已知的（Verma和Somia(1997)Nature389: 239-242)O
[0056]存在多种逆转录病毒。对于本申请，术语"逆转录病毒"包括:鼠白血病病毒(MLV)、 人免疫缺陷病毒化IV)、马传染性贫血病毒化IAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、鲁斯氏肉瘤 病毒(RSV)、藤波肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、阿贝尔森鼠白血病病毒(A-MLV)、禽骨髓细胞瘤病病毒-29(MC29)，和禽成红细胞增多症病毒(AEV)，W及所有其它逆转录病毒科，包括慢病毒。
[0057] 逆转录病毒的详细列表可见述于Coff in等（"逆转录病毒"1997冷泉港实验室出版 社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)编者:J M Coffin，S M Hughes，H E Varmus 第758-763页）。
[0058] 慢病毒也属于逆转录病毒家族，但其既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞 [Lewis等（1992)EMB0 J.3053-3058]。
[0059] 慢病毒组可分成"灵长类"和"非灵长类"。灵长类慢病毒的示例包括:人免疫缺陷 病毒化IV)，人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的成因，W及猿免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类 慢病毒类包括"缓慢病毒(slow virus)"表型绵羊脱髓銷性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎病 毒(VMV)，W及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒巧IAV)，和最近报道 的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
[0060] -些慢病毒的基因组结构的详细内容可在本领域中寻得。例如，关于HIV和EIAV的 详细内容可获自NCBI Genbank数据库（即，分别为基因组登录号AF033819和AF033820)。关 于HIV变体的详细内容可获自洛斯阿拉莫斯国家实验室化OS Alamos National Laboratory)维护的HIV数据库。关于EIAV克隆的详细内容可获自国立卫生研究院 (化tional Institutes Of Health)维护的NCBI数据库。还参见美国专利号7,790,419;7， 585,676；7,419,829；7,351,585；7,303,910；7,198,784；7,070,994；6,924,123；6,818, 209 ;6,808,922 ;6,800,281 ;6,783,981 ;6,541,248 ;6,312,683 和6,312,682。
[0061] 在感染过程中，逆转录病毒最初先连接至特定的细胞表面受体。在进入易感宿主 细胞后，逆转录病毒RNA基因组随后通过病毒编码的逆转录酶（携带于母病毒内）拷贝至 DNA。该DNA被运输至宿主细胞核，其随后整合进入宿主基因组。此时，通常称之为原病毒 (provirus)。细胞分裂过程中，原病毒在宿主染色体中稳定，并且像其它细胞基因一样转 录。原病毒编码制造更多病毒所需的蛋白质和其它因子，它们可通过有时称为"出芽"的方 式离开细胞。
[0062] 各逆转录病毒基因组可包含称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒蛋白质和 酶。运些基因侧接在称为长末端重复化TR)区域的两个末端。LTR致力于原病毒整合和转录。 它们还起到增强子-启动子序列的作用。换言之，LTR可控制病毒基因的表达。逆转录病毒 RNA的衣壳化通过位于病毒基因组的5'末端的PSi序列发生。
[0063] LTR本身是相同序列，其可分成S种元件，称为U3、R和呪。U3衍生自RNA的3 '末端独 有的序列。R衍生自在RNA的两端重复的序列，而U5衍生自RNA的5'末端独有的序列。运S种 元件的大小在不同逆转录病毒中可有显著变化。
[0064] 对于病毒基因组，转录起始的位点位于LTR左手边的U3和R之间的边界，并且，多聚 (A)添加(终止)位点位于LTR右手边的R和U5之间的边界。U3包含原病毒的大多数转录控制 元件，其包括，响应细胞且在一些情况中响应病毒转录活化蛋白质的多个增强子序列和启 动子。一些逆转录病毒具有，编码基因表达的调控中设及的蛋白质的，如下基因中的任何一 个或多个：tat、rev、tax 和rex。
[0065] 关于结构基因 gag、pol和env本身；gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白经蛋白 水解处理成为成熟蛋白质MA(基质）、CA(衣壳)和NC(核衣壳Kpol基因编码逆转录酶(RT)， 其包括DNA聚合酶，相关的RNA酶H和整合酶（IN),其介导基因组的复制。env基因编码病毒粒 的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，其形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。该 相互作用最终导致通过病毒膜和细胞膜的融合发生的感染。
[0066] 逆转录病毒还可包含"额外"基因，其编码除gag、pol和envW外的蛋白质。额外基 因的示例包括在^￥中，￥1；1^￥口1'、￥口义、￥口11、1曰1：^6￥和]16；1!'中的一个或多个。EIAV具有，例如， 额外基因 S2和加 TP酶(加 T化Se)。
[0067] 额外基因编码的蛋白质具有多种功能，其中一些可与细胞蛋白所具有的功能相重 复。例如，在EIAV中，tat起到病毒LTR的转录活化物的作用。其结合至稳定的、称为TAR的茎 环RNA二级结构。Rev通过rev-响应元件(RRE)调控并调整病毒基因的表达。认为运两种蛋白 质的作用机制与灵长类病毒中类似的机制广泛类似。S2的功能未知。此外，EIAV蛋白，Ttm, 已经鉴定由，与在跨膜蛋白的起始处与env编码序列拼接的化t的第一个外显子编码。
[0068] 已提出将逆转录病毒载体系统作为递送系统，用于(尤其是)将NOI传递至一个或 多个感兴趣的位点。所述转移可体外、离体、体内，或其组合发生。
[0069] 重组逆转录病毒载体颗粒能够用NOI转导受者细胞。一旦进入细胞，来自载体颗粒 的RNA基因组即被逆转录成DNA，并整合进入受者细胞的DNA。
[0070] 本文中所用术语"载体基因组"指的是逆转录病毒载体颗粒中存在的RNA构建体 和/或整合的DNA构建体。该术语还涵盖能够编码所述RNA基因组的独立的或分离的DNA构建 体。逆转录病毒或慢病毒基因组可包含可部分源自逆转录病毒或慢病毒的至少一种组分。 术语"可源自"W其常用含义使用，W表示不必需获自病毒(例如慢病毒)但可由其衍生的核 巧酸序列或其部分。例如，该序列可通过合成制备，或通过采用重组DNA技术制备。优选地， 所述基因组可包含PSi区（或能够造成衣壳化的类似的组分）。
[0071] 病毒载体基因组优选地是"复制缺陷型"的，其中所述基因组本身不包含足W允许 独立复制W在受者细胞中产生感染性病毒颗粒的充足的遗传信息。在一个优选实施方式 中，所述基因组缺乏功能性env、gag或pol基因。
[0072] 所述病毒载体基因组可包含长末端重复化TR)区的一些或全部。优选地，所述基因 组可包含LTR或类似的序列的至少部分，其能够介导原病毒的整合和转录。所述序列还可包 含或作为增强子-启动子序列。
[0073] 本发明第二方面的病毒载体基因组可W试剂盒的部分形式提供。例如，所述试剂 盒可包含(i)含有NOI和内部调控序列(例如，启动子或者一个或多个IRES序列）的一种或多 种质粒;和（ii)具有适于将NOI和一个或多个内部调控序列克隆进入病毒基因组的限制性 酶识别位点的逆转录病毒基因组构建体。
[0074] 已知，W共同导入相同细胞的分开的DNA序列产生逆转录病毒载体颗粒所需的组 分的分开表达，将产生携带缺陷型逆转录病毒基因组的逆转录病毒颗粒，其携带治疗性基 因（例如，MiIler的综述1992)。该细胞称为生产(producer)细胞(见下文）。
[0075] 产生生产细胞的常用方式有两种。其中一种，将编码逆转录病毒Gag、Pol和Env蛋 白的序列导入细胞，并稳定地整合进入细胞基因组;产生称为"包装细胞系"的稳定的细胞 系。包装细胞系产生包装逆转录病毒RNA所需的蛋白质，但因缺乏PSi区，其不造成衣壳化。 然而，当将具有PSi区的载体基因组导入包装细胞系时，辅助蛋白可包装PSi-阳性重组载体 RNA，W生成重组病毒储物。运可用于将NOI转导进入受者细胞。具有缺乏生成病毒蛋白质所 需的全部基因的基因组的重组病毒仅可感染一次，且无法繁殖。因此，NOI被导入宿主细胞 基因组，但不产生可能有害的逆转录病毒。关于可用的包装细胞系的总结可见于"逆转录病 毒"（1997冷泉港实验室出版社，编者:J M Coffin，S M Hu曲es，H E化rmus第449页）。
[0076] 本发明还提供一种包装细胞系，其可包含本发明的病毒载体基因组。例如，所述包 装细胞系可用，可包含所述基因组的病毒载体系统转导，或用携带能够编码所述RNA基因组 的DNA构建体的质粒转染。本发明还提供通过所述细胞产生的逆转录病毒(或慢病毒)载体 颗粒。
[0077] 第二种方式是，通过瞬时转染，将产生逆转录病毒载体颗粒所需的S种不同DNA序 列（即，env编码序列、gag-pol编码序列和包含一个或多个NOI的缺陷型逆转录病毒基因组） 同时引入细胞，并且该过程称为瞬时S重转染[Landau和Littman(1992)J Virol 66:8 5110-5113;化ar等（1993)Proc natl Acad Sci USA90:18 8392-6]。该S重转染过程已被 优化（Soneoka等Nucleic Acids Res(1995)23:4 628-633;Finer等（1994)Blood 83:43-50] dWO 94/29438描述了采用该多重DNA瞬时转染方法体外生成生产细胞。
[0078] 补充该载体基因组所需的、所述病毒系统的组分，可存在于一种或多种"生产质 粒"上，供于转染进入细胞。
[0079] 本发明还提供一种减少与逆转录病毒载体相关的肿瘤发生的方法，所述逆转录病 毒载体包含含有X区的WPRE，所述方法包括用间隔子或填充核巧酸序列（SNS)替换包含X区 的 WRE。
[0080] 所述SNS可如本文中定义。
[0081] 用SNS替换包含X区的WPRE惊人地削弱了所述载体转染进入细胞时的肿瘤发生作 用，但保持复制的高保真度且有效增强转基因复制。因此，相对于包含WPRE/X区序列的载体 而言，提高了该逆转录病毒载体的安全性能。
[0082] 本发明还提供一种用于产生逆转录病毒源性颗粒的载体系统，其可包含（i)本发 明第二方面所述的逆转录病毒基因组；（ii)编码逆转录病毒gag和POl蛋白的核巧酸序列； (iii)编码其它必需的病毒包装组分的核巧酸序列，所述其它必需的病毒包装组分不被 (ii)的核巧酸序列编码。
[0083] 优选地，破坏来自衍生所述颗粒的逆转录病毒且的，编码化r、Vif、化t、化f或类似 的辅助基因中至少一种的，一种