ight-Glo? 巧光素酶分析底物(普洛麦格E2620)。对应于巧光素酶表达水平的各孔的发光（相对光单 位，化U)通过Wallac Victors 1420酶标仪(帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))测量。采用标 准曲线，将各样品孔的发光转换成活性巧光素酶的浓度（Wng/mL计）。
[020引缉里
[0209] ^^毒载体制备物中完整载体颗粒水平的测量
[0210] 如图8所示，Luc、LucNoX和LucNoW慢病毒载体制备物中，慢病毒载体相关的p24gag 衣壳蛋白的水平相似。运表明，运些慢病毒载体制备物包含相似水平的载体颗粒。用于重悬 运些载体的病毒载体团块的完整培养基巧h充有l〇%v/v胎牛血清(FBS)和2mM GlutaMaX的 达氏修正依氏培养基(DMEM)培养基]不产生任何背景信号。
[0211] 来自供体的原发性T细胞和祀细胞-SupTl细胞系的慢病毒载体转导，和细胞团块 收获
[0212] 图9中的结果显示，在一定载体稀释范围中，用转移质粒祀LNS LucNoX ADB679产 生的LucNoX慢病毒载体转导的S叩Tl细胞表达出的巧光素酶活性稍高于用pELNS Luc ADB678质粒产生的Luc对照载体。运是预料中的，因为已在先前显示，采用包含不表达X蛋白 的WPRE突变体的转移质粒产生的慢病毒载体与全长WPRE在转基因表达增强相关的功能上 是类似的[Gonzalez-Murillo A.等（2010).Hum Gene Ther 21(5) :623-30;Schambach A. 等（2006)Gene Therl3(7):641-5]。
[0213] 此外，在一定载体稀释度范围中，采用转移质粒pELNS LucNoW ADB680产生的 LucNoW慢病毒载体转导的细胞表达的巧光素酶活性同样稍高于采用Luc对照的那些（图9)。 运显示，六核巧酸TCTAGA(甜al限制性酶切位点）可用于替换功能性WPRE元件。
[0214] 用表达巧光素酶报告基因的Luc ,LucNoX和LucNoW载体转导的SupTl细胞或原发性 T细胞中的活性巧光素酶表达
[0215] 为了进一步评价能否在原发性T细胞中再现运些结果，采用相同批次的Luc、 LucNoX和LucNoW载体的最高剂量重复上述实验。并且，采用相同批次的S叫Tl细胞作为对 照。
[0216] 如图10所示，用LucNoX慢病毒载体转导的，从四种不同供体分离的原发性T细胞W 及SupTl表达的巧光素酶活性高于采用Luc对照载体的那些。
[0217] 此外，用LucNoW慢病毒载体转导的细胞表达的巧光素酶活性高于采用Luc对照或 LucNoX载体的那些（图10)。运与先前实验的结果一致，即完整WPRE元件可被短间隔子元件 替换，同时对载体效价没有任何影响。
[0218] 实施例2
[0219] 质粒NoWPRE 0聚体、NoWPRE 3聚体、NoWPRE 10聚体，NoWPRE 20聚体、NoWPRE 30聚 体、NoWPRE 40聚体和NoWPRE 50聚体的构建。
[0220] "Luc NoW 0聚体"质粒通过用SaU和EcoRr消化ADB680质粒（图7)产生。然后，载体 主链片段用T4聚合酶处理，随后连接。新质粒不再包含Sail和EcoRI位点（图2)。
[0221] 质粒通过如下方式产生：对互补寡聚物退火，W形成（随机选择）含有待连接的 Sail和EcoRI限制性位点相容末端的填充序列（参见表1)。然后，将退火的填充序列连接进 入SaU和EcoRr消化的ADB 680质粒主链，W形成对应的质粒。运些质粒包含SaU和EcoRI限 制性位点。
[0222] 表1:包含具有待连接Sail和EcoRI限制性位点相容末端(粗体）的填充序列的退火 的接头：
[0223]
[0224] 因此，插入的填充序列如下：
[0225]
[0226]
[0227]
[022引
[0229]
[0230]
[0231 ]表达巧光素酶或NYES0-1TCR的重组慢病毒载体的产生
[0232]重组慢病毒载体采用人皿K293T细胞系作为宿主，通过如下方式产生：瞬时转染4 种质粒-包含巧光素酶报告基因或NYESO-IT细胞受体(TCR)表达盒的转移质粒，和表达结构 HIV-lgag-pol基因、附属基因 rev或病毒包膜水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G)的S种包装质 粒。转染后48小时收集上清液，并过滤通过0.45WI1滤器来去除细胞碎片。然后，澄清的病毒 上清液通过超速离屯、Wl〇,〇〇〇x g离屯、16-18小时。然后，将病毒颗粒团块重悬于适当体积 的培养基。
[0233] 包含巧光素酶化UC)或NY-ESOlT细胞受体(NY-ESOl)，并且包含WPRE(所述WPRE缺 乏X-片段)或缺乏WPRE的慢病毒载体如表2所示：
[0234] 表2:采用不同转基因质粒产生的慢病毒载体汇总
[0235]
[0236]
[0237] 祀细胞-SupTl细胞系的慢病毒载体转导
[0238] 通过转导人SupTl细胞系来评价巧光素酶报告基因或NYESO-I TCR在祀细胞中的 表达。对于转导，SupTl细胞经沉淀并重悬于新鲜培养基。将运些细胞WlxlO6个细胞/孔的 密度，WO. 5mL/孔接种于24孔板。然后向孔添加 0.5ml的慢病毒载体。
[0239] 转导的SupTl细胞W细胞团块形式收获[300X g离屯、5分钟]，用于测量48小时后的 巧光素酶表达。为了测量NYES0-1TCR，运些细胞用针对TCR的0-链产生的特异性抗体染色， 并且通过流式细胞术测定阳性标记细胞的百分比。
[0240] 用从表达巧光素酶的转基因质粒衍生的慢病毒载体转导的SupTl细胞中的活性巧 光素酶的表达，所述转基因质粒包含全长WPRE或WPRE替换性填充序列。
[0241] 剧烈满旋1分钟后，SupTl细胞团块与适当量的冷Glo裂解缓冲液(普洛麦格公司 (Promega化2661)在冰上解育巧分钟。然后，使细胞裂解物在冰上保留至使用。采用Glo裂解 缓冲液中稀释的适当量的QuantiLum重组巧光素酶(Promega E1701)产生巧光素酶标准曲 线。然后，将适当量的标准品和样品添加至实体壁白色96孔板（葛莱娜第一生化公司 (Greiner Bio)目录号655083)的孔。向各孔添加平衡至室溫的I(K)化的重建化ight-Glo?巧 光素酶分析底物(普洛麦格E2620)。对应于巧光素酶表达水平的各孔的发光(相对光单位， 化U)通过化UOStar Omega酶标仪(BMG实验室技术公司（BMG LabTech))测量。采用标准曲 线，将各样品孔的发光转换成活性巧光素酶的浓度（Wng/mL计）。
[0242] 对各转基因质粒制备四种单独慢病毒载体制备物。图11中的结果来自典型制备 物，并且代表S次重复测定结果的平均值，其经标准化W给出计为100%的Luc载体发光。在 不存在WPRE的情况中，转基因的表达显著减少，但该表达可通过添加3至50个核巧酸的"填 充序列"而被恢复。
[0243] 用NY-ESOl WPRE NoX或NY-ESOl NoW 6聚体转导的S叫Tl细胞的细胞表面上的 NYESO-I TCR表达。
[0244] 为了评价表达NYESO-IT细胞受体基因（Robins等[2008] J Immunol 180:9，611)的 慢病毒载体能否获得类似结果，一些SupTl细胞用，包含截短的WPRE NYESOl WPRE NoX或用 6核巧酸[TCTAGA]序列NY-ESOl NoW 6聚体替换的WPRE的表达NYESO-I的转基因质粒衍生的 慢病毒载体转导。
[0245] 转导后，SupTl细胞的培养基用FACS缓冲液[PBS，pH 7.4，不含巧和儀，用2%。85和 2mM邸TA补充]替换，所述缓冲液包含针对NYESO-I TCR的W亚基产生的13.1胖E偶联抗体 (贝克曼库尔特(Beckman Coulte;r)IM2292)，对于96孔板稀释至化1/孔。然后，采用Accuri C6流式细胞仪(抓生物科学公司(BD BioSciences))，通过流式细胞术测定群中的阳性标记 细胞百分比。
[0246] 如图12所示的结果显示，相较于用包含WPRE的载体(NYES01 WPRE NoX)转导的细 胞，采用包含填充序列（NYES01 NoW 6聚体）的载体转导的细胞能够产生类似百分比的 NYESOl TCR表达型细胞。
[0247] 如此详细地描述了优选实施方式后，应理解，上文所定义的本发明不限于说明书 中所列的特定细节，能够在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种明显的变化。
【主权项】
1. 一种工程改造的或非天然产生的逆转录病毒载体，其包含插入以替换土拨鼠肝炎病 毒转录后调控元件(WPRE)的间隔子或填充核苷酸序列（SNS)，其中所述SNS对于所述载体是 异源的，并且不包含起始密码子。2. -种工程改造的或非天然产生的逆转录病毒载体，其包含并表达感兴趣的核苷酸序 列(NOI)和间隔子或填充核苷酸序列（SNS)以刺激NOI的表达，其中所述SNS对于所述载体是 异源的，并且不包含起始密码子。3. 如权利要求2所述的载体，其中，所述载体不包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件 (ffPRE)〇4. 如权利要求1或3所述的载体，其中所述WPRE包含X区。5. 如权利要求1-4中任一项所述的载体，其中所述SNS的长度是约3-约50个核苷酸。6. 如权利要求1-4中任一项所述的载体，其中所述SNS的长度是约3-约10个核苷酸。7. 如权利要求1-4中任一项所述的载体，其中所述SNS包含SEQ ID NO: 1的序列。8. 如权利要求1或4-7中任一项所述的载体，其中所述载体包含至少一种感兴趣的核苷 酸序列(N0I)。9. 如权利要求1-8中任一项所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。10. 如权利要求9所述的载体，其中所述慢病毒载体是最小慢病毒载体。11. 如权利要求9或10所述的载体，其中，所述慢病毒载体衍生自选自下组的病毒物种： 人免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎 病毒（VMV)、山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒 (FIV)，和牛免疫缺陷病毒(BIV)。12. 如权利要求1-11中任一项所述的载体，其中，破坏编码Rev的核酸序列，从而所述核 酸序列编码非功能性Rev。13. 如权利要求1-12中任一项所述的载体，其中，破坏编码Tat的核酸序列，从而所述核 酸序列编码非功能性Tat。14. 如权利要求1 -13中任一项所述的载体，其中，所述载体包含中心聚嘌呤区（cPPT)序 列。15. 如权利要求1-14中任一项所述的载体，其中所述载体包含gag-包装信号，所述gag-包装信号含有ATG基序。16. 如权利要求15所述的载体，其中所述ATG基序是ATTG基序。17. 如权利要求1-16中任一项所述的载体，其中所述载体是多顺反子。18. 如权利要求1-17中任一项所述的载体，其中所述载体包含至少一种内部调控元件。19. 如权利要求18所述的载体，其中所述内部调控元件是启动子。20. 如权利要求18或19所述的载体，其中所述内部调控元件是内部核糖体进入位点 (IRES)。21. -种用于产生逆转录病毒源性的载体颗粒的逆转录病毒载体系统，其包含（i)权利 要求1-20中任一项所述的载体，（ii)编码逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列，和（iii) 编码其它必需病毒包装组分的核苷酸序列，所述其它必需病毒包装组分不被(ii)的核苷酸 序列编码。22. 如权利要求21所述的系统，其中，破坏编码￥?^￥1€3&11^^或类似的辅助蛋白中 至少一种的一种或多种核酸序列，例如，所述一种或多种核酸序列编码非功能性Vpr、Vif、 Tat、Nef或类似的辅助蛋白。23. 如权利要求21或22所述的系统，其中，所述载体系统用异源env蛋白的至少部分假 型化。24. 如权利要求23所述的系统，其中，所述异源env蛋白衍生自狂犬病-G或VSV-G。25. 由权利要求21-24中任一项所述的系统产生的病毒颗粒。26. 用权利要求21 -24中任一项所述的系统转导的细胞。27. -种组合物，其包含权利要求1-26中任一项所述的载体、系统、颗粒或细胞，以及运 载体或稀释剂。28. -种用于将至少一种NOI递送至靶细胞的方法，所述方法包括:将权利要求1-21中 任一项所述的载体引入靶细胞，由此将所述NOI递送至所述靶细胞。29. -种增强NOI在逆转录病毒或慢病毒表达载体中的转录的方法，所述方法包括引入 SNS，将其插入并替换所述NOI下游的WPRE，其中，相较于WPRE的情况，在将SNS插入并替换 WPRE的情况下，所述NOI的表达更高。30. 如权利要求29所述的方法，其中，所述WPRE包含X区。31. 如权利要求29或30所述的方法，其中所述SNS的长度是约3-约50个核苷酸。32. 如权利要求29或30所述的方法，其中所述SNS的长度是约3-约10个核苷酸。33. 如权利要求29或30所述的方法，其中所述SNS包含SEQ ID NO: 1-7中任一条的序列。34. 如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述载体是慢病毒载体。35. 如权利要求34所述的方法，其中所述慢病毒载体是最小慢病毒载体。36. 如权利要求34所述的方法，其中，所述慢病毒载体衍生自选自下组的病毒物种：人 免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎病 毒(VMV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)， 和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
【专利摘要】本发明涉及一种载体系统，其涉及用不相关的短间隔子序列替换土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列，供于感兴趣的核苷酸在逆转录病毒载体系统中的高效表达，以及用于递送并表达感兴趣的核苷酸至靶细胞的方法。
【IPC分类】C12N15/86
【公开号】CN105705646
【申请号】CN201480058619
【发明人】O·阚
【申请人】艾达普特免疫有限公司
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2014年10月24日
【公告号】CA2923998A1, US20150118714, WO2015059276A1