ng Co.) ,A.R.Gennaro编，1985)。药用运载体、赋形剂或稀释剂的选择可基 于指定的给药途径和标准药学实践。除运载体、赋形剂或稀释剂W外，药物组合物还可包含 任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣试剂、增溶剂。
[0175] 药物组合物可包含防腐剂、稳定剂、染料、甚至是调味剂。防腐剂的例子包括苯甲 酸钢、山梨酸和对径基苯甲酸醋。也可使用抗氧化剂和助悬剂。
[0176] 根据不同的递送系统，存在不同的组成/配制要求。例如，本发明药物组合物可配 制成采用微型累或通过粘膜途径递送，例如作为鼻腔喷雾剂或吸入气溶胶或可摄取溶液 剂，或者经胃肠外递送，其中，用可注射形式配制所述组合物，例如通过静脉内、肌肉内或皮 下途径递送。或者，制剂可设计成经两种途径递送。
[0177] 如果药物组合物经胃肠道粘膜的粘膜途径递送，该试剂应在转运通过胃肠道过程 中保持稳定，例如应耐受蛋白水解降解，在酸性抑下稳定并且耐受胆汁的清除作用。
[0178] 适当时，药物组合物吸入给予，W栓剂或阴道栓的形式给予，W洗剂、溶液剂、乳 膏、软膏或撒粉的形式外用，使用皮肤贴片，W包含淀粉或乳糖或白聖(Cha化)等赋形剂的 片剂形式口服给予，或单独或与赋形剂混合的胶囊或卵泡形式，W包含调味剂或着色剂的 馳剂、溶液剂或混悬剂形式给予，或者可W胃肠外注射给予，例如静脉内、肌内或皮下。对于 胃肠外给药，运些组合物最好是无菌水溶液形式，可包含其他物质如足量的盐或单糖W使 溶液与血液等渗。对于含服或舌下给药，运些组合物可W是采用常规方式配制的片剂或锭 剂形式。
[0179] 通常，医师都可确定对单个患者而言最适用的实际剂量且其会根据特定个体的年 龄、体重和反应，W及病症的严重程度而变化。对一般情况的示例剂量如下。当然，可能会存 在应用较高或较低剂量范围的个别情况。
[0180] 本发明的组合物(或其部分组分)可W经口给予。此外或替代性地，本发明的组合 物(或其部分组分)可W通过直接注射给予。此外或替代性地，本发明的组合物(或其部分组 分)可W局部给予。此外或替代性地，本发明的组合物（或其部分组分)可W通过吸入给予。 此外或替代性地，本发明的组合物(或其部分组分)还可W通过如下一种或多种方式给予： 胃肠外、粘膜、肌内、静脉内、皮下、眼内或透皮给予方式，并且配合所述给予制备。
[0181] 再举例而言，本发明的药物组合物可按照1-10次/天，例如1次或2次/天的方案给 予。任何具体患者的特定剂量水平和剂量频率可能不同，运取决于各种因素，包括所用特定 化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用长度、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食， 给药方式和时间、排泄率、联合用药、具体病症的严重程度和接受治疗的宿主。
[0182] 术语"给予"还包括但不限于，通过如下途径的递送:粘膜途径，例如，作为用于吸 入的鼻喷雾或气溶胶形式，或作为可消化溶液形式；胃肠外途径，其中递送通过可注射形式 进行，例如，静脉内、肌内或皮下途径。
[0183] 因此，可通过如下途径中的一种或多种给予本发明的药物组合物:经口给予、注射 (例如直接注射）、局部、吸入、胃肠外给予、粘膜给予、肌内给予、静脉内给予、皮下给予、眼 内给予或透皮给予。
[0184] 可包含有效量的载体(其可包含操作性地连接至NOI的经鉴定的调节部分)的药物 组合物可用于疾病治疗，例如WO 98/09985中所列那些。为便于参考，提供列表的部分:巨隧 细胞抑制和/或T细胞抑制活性，W及由此产生的抗炎性活性;抗免疫活性，即，对细胞和/或 体液免疫应答(包括不与炎症相关的应答）的抑制作用；与病毒和/或其它胞内病原体相关 的疾病；对于巨隧细胞和T细胞粘附至胞外基质组分和纤连蛋白的能力的抑制，W及对于T 细胞中上调的化S受体表达的抑制;抑制不希望的免疫反应和炎症，包括关节炎，包括类风 湿性关节炎、与如下病症相关的炎症:超敏性、过敏反应、哮喘、全身性红斑狼疮、胶原性疾 病和其它自体免疫疾病相关的炎症，与动脉粥样硬化、动脉硬化、动脉粥样硬化性屯、脏病、 再灌注损伤、屯、搏骤停、屯、肌梗死、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征或其它屯、肺疾病相关的 炎症，与消化性溃瘍、溃瘍性结肠炎和胃肠道的其它疾病、肝纤维变性、肝硬化或其它肝疾 病、甲状腺炎或其它腺体疾病、肾小球性肾炎或其它肾与泌尿疾病，耳炎或其它耳鼻咽喉部 疾病、皮炎或其它皮肤疾病、牙周疾病或其它牙疾病、睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育、睾丸外 伤或其它免疫相关的睾丸疾病、胎盘功能素乱、胎盘功能不全、习惯性流产、子痛、先兆子痛 和其它免疫和/或炎性相关的妇科疾病、后葡萄膜炎、中间体眼色素层炎、前葡萄膜炎、结膜 炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症，例如视网膜炎或黄斑囊样水 月中、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、退行性眼底病的免疫和炎性组分、眼外伤的炎性 组分、感染引起的眼炎、增殖性玻璃体视网膜病变、急性缺血性视神经病、过大伤痕(例如在 青光眼滤过手术之后）、对眼植入物的免疫和/或炎症反应，W及其它免疫和炎性相关的眼 科疾病、与自体免疫疾病或病症或素乱相关的炎症(其中在中枢神经系统(CNS)或任何其它 器官中，免疫和/或炎症抑制是有益的）、帕金森病、由治疗帕金森病所产生的并发症和/或 副作用、AIDS相关的痴呆合并症、HIV相关脑病、视神经脊髓炎、薛登汉氏舞蹈病、阿尔兹海 默病和其它退行性疾病、CNS的病症或素乱、斯托克斯病的炎性组分、脊髓灰质炎后综合征、 精神障碍的免疫和炎性组分、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、 亚急性神经病、慢性神经病、格林-己利综合征、薛登汉氏舞蹈症、重症肌无力、假性脑瘤、唐 氏综合征、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、CNS压迫或CNS外伤或CNS感染的炎性组分、肌萎缩 和营养不良的炎性组分，W及免疫和炎性相关的中枢和周围神经系统的疾病、病症或素乱、 外伤后炎症，脈毒性休克，传染病，手术的炎症并发症或副作用、骨髓移植或其它移植并发 症和/或副作用、基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用，例如由于感染病毒载体，或者 与AIDS有关的炎症，用于压低或抑制体液和/或细胞免疫应答，用于通过减少单核细胞或淋 己细胞的量而治疗或改善单核细胞或白细胞增殖性疾病，例如白血病，在移植天然或人工 细胞、组织和器官（如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器）、天然或人造皮肤组织的情况下用 于预防和/或治疗移植排斥。特定的癌相关疾病包括但不限于:实体瘤;血源性肿瘤，例如白 血病;肿瘤转移；良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脈性肉芽肿;类风 湿性关节炎；牛皮癖；眼部血管生成疾病，例如，糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、黄 斑变性、角膜移植排斥反应、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织形成、虹膜发红;奥韦综 合征；屯、肌血管生成;斑块新生血管;毛细管扩张;血友病性关节病;血管纤维瘤;创面侧芽； 冠状动脉侧支;脑络;动静脉崎形;缺血性四肢血管生成;新生血管性青光眼；晶状体后纤维 组织形成;糖尿病新生血管形成;螺杆菌相关疾病、骨折、血管生成、造血作用、排卵、月经和 胎盘形成。
[0185] 尽管已经详细描述了本发明和其优势，但是应当理解，可对本文进行各种变化、替 代和改变而不背离所附权利要求所定义的本发明的精神和范围。
[0186] 本发明将W实施例进行进一步说明，实施例仅用于说明目的，且不W任何方式限 制本发明。 实施例
[0187] 实施例1
[0188] 移除±拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，W提高病毒载体的安全性能。
[0189] 进行研究，W评估WPRE的移除对于逆转录病毒载体的蛋白质表达水平的作用。
[0190] 遞
[0191] 转移质粒'P化NS Luc ADB678''P化NS LucNoX ADB679'和'P化NS LucNoW ADB680'的构建
[0192] 基于pELNS-NY-ESO ADB152质粒（图 1)，构建了称为祀LNS-NY-ESO NoX ADB693和 祀LNS-NY-ESO NoW ADB694的两个变体。对于祀LNS-NY-ESO NoX ADB693的构建，通过采用 正向引物[核巧酸序列：cgGTCGACaatcaacctctggattac]和反向引物[核巧酸序列： cgGAATTCgacaacaccacggaattgtc]，采用Platinum !"aq DNA聚合酶PCR试剂盒（生命技术公 司化ife Technologies)目录号#11304011)，进行PCR扩增来修饰祀LNS-NY-ESO ADB152质 粒的WPRE区。PCR产物用SaU和EcoRI限制性酶消化，然后采用幻mo清洁与浓缩试剂盒(Zymo 研究公司，目录号D4005)来纯化。然后，将纯化的片段连接进入SalLEcoRI消化的pELNS-NY-ESO ADB152质粒主链片段，W形成祀LNS-NY-ESO NoX ADB693质粒（图2)。
[0193] 对于祀LNS-NY-ESO NoW ADB694质粒的生成，两种5'-憐酸化的寡核巧酸[上方链 寡核巧酸序列：tcgacTCTAGAg;下方链寡核巧酸序列：aattcTCTAGAg]经退火，W形成包含 SalIJ(baI_EcoRI位点和'粘性'Sail和EcoRI限制性酶末端的接头：
[0194]
[0195] 然后，将退火的援头连援进入SalLEcoRI消化的祀LNS-NY-ESO ADBl52质粒主链 片段，W形成祀LNS-NY-ESO NoW ADB694质粒（图3)。
[0196] 然后，分别采用祀LNS-NY-ESO ADB152、祀LNS-NY-ESO NoX ADB693和pELNS-NY-ESO NoW ADB694质粒来产生pELNS Luc ADB678、pELNS LucNoX ADB679和pELNS LucNoW ADB680 质粒。
[0197] 对于pELNS Luc ADB678质粒的生成，采用正向引物[核巧酸序列： ACTGGCTAGCCACCatggaagatgccaaaaaca]和反向引 物[核巧酸序列： gaggttgattgtcgacttac]，通过PCR，从祀LNS Tomato-Luc ADB73质粒（图4)扩增巧光素酶报 告基因[在5'端侧接化el限制性酶切位点，并在3'端侧接Sail位点]。PCR产物用化el和SalI 限制性酶消化，然后采用幻mo清洁与浓缩试剂盒纯化。然后，将纯化的片段连接进入Nhel_ Sair消化的pELNS-NY-ESO ADB152、pELNS-NY-ES0 NoX ADB693和pELNS-NY-ESO NoW ADB694质粒主链片段，W分别产生pELNS Luc ADB678、pELNS LucNoX ADB679和pELNS LucNoW ADB680质粒（图5-7)。
[0198] 表达巧光素酶的重组慢病毒载体的产生
[0199] 重组慢病毒载体采用人皿K293T细胞系作为宿主，通过如下方式生成：瞬时转染4 种质粒-包含巧光素酶报告基因表达盒的转移质粒，和表达结构HIV-lgag-pol基因、附属基 因 rev或病毒包膜水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G)的S种包装质粒。转染后48小时收集上清 液，并过滤通过0.45WI1滤器来去除细胞碎片。然后，通过W10，OOOx g超速离屯、16-18小时， 从澄清的上清液浓缩慢病毒载体颗粒。最终将病毒颗粒团块重悬于适当体积的培养基。
[0200] 采用祀LNS Luc ADB678[全长WPRE元件]、祀LNS LucNoX ADB679[通过移除X-启动 子截短的WPRE元件和在3'端截短的X-蛋白]或祀LNS LucNoW ADB680[用6个核巧酸TCTAGA 替换WPRE元件]转移质粒产生的慢病毒载体分别称为'Luc'、'LucNoX'或'LucNoW'载体。 [0201 ]慢病毒载体制备物中完整载体颗粒水平的检测
[0202] 完整的慢病毒载体颗粒的水平采用QuickTiter慢病毒效价试剂盒(细胞生物实验 室公司（Cell Biolabs Inc),目录号VPK-107)测定。该分析试剂盒仅测量与p24gag衣壳蛋 白相关但不与病毒载体制备物中存在的游离p24蛋白质相关的慢病毒载体颗粒。因此，该分 析的结果可用作慢病毒载体的生物学效价的替代。
[0203] 祀细胞-SupTl细胞系和来自多个供体的原发性T细胞的慢病毒载体转导，和细胞 团块收获
[0204] 通过转导人SupTl细胞系或来自多个供体的原发性T细胞来评价巧光素酶报告基 因在祀细胞中的表达。对于SupTl细胞的转导，使SupTl细胞沉淀并重悬于新鲜培养基。将运 些细胞W IxlO6个细胞/孔的密度，WO . 5mL/孔接种于24孔板。然后，向孔添加0. SmL的慢病 毒载体[Luc,LucNoX或LucNoW]。转导的S叫Tl细胞W细胞团块形式收获[300X g离屯、5分 钟]，用于测量48小时后的巧光素酶表达。
[0205] 对于来自多个供体的原发性T细胞的转导，采用Lymphoprep试剂盒（轴盾公司 (Axis-化ield)，目录号NYC-1114547)，按照生产商说明书，从供体的全血分离包括T细胞在 内的白细胞。通过与适当量的人CD14和CD25微珠（美天旋生物技术公司（Mi Itenyi Biotech)目录号130-050-201,130-092-983)解育，然后用Milten}d LS柱(美天旋生物技术 公司，目录号130-042-401)分离，从该群移除CD14和CD25阳性白细胞。适当量的剩余细胞与 适当量的重组白介素-2和适当量的抗CD3/抗CD28珠解育。解育过夜后，将运些细胞WlmL体 积中IO 6个细胞/孔转移至24孔板。然后，向孔添加 ImL的慢病毒载体[Luc ,LucNoX或 LucNoW]。转导的原发性T细胞W细胞团块形式收获[300X g离屯、5分钟]，用于测量48小时后 的巧光素酶表达。
[0206] 用表达巧光素酶报告基因的Luc ,LucNoX和LucNoW载体的连续稀释物转导的SupTl 细胞中的活性巧光素酶表达
[0207] 剧烈满旋1分钟后，SupT 1细胞团块与适当量的冷GlO裂解缓冲液（普洛麦格 (Promega化2661)在冰上解育巧分钟。然后，使细胞裂解物在冰上保持至使用。采用Glo裂解 缓冲液中稀释的适当量的QuantiLum重组巧光素酶(普洛麦格(Promega化1701)产生巧光素 酶标准曲线。然后，将适当量的标准品和样品添加至实体壁白色96孔板(葛莱娜第一生化公 司（Greiner Bio)目录号655083)的孔。向各孔添加平衡至室溫的10化L的重建化