[0074] 2.3基于马铃馨基因组区段特异标记开发
[0075] 根据上述两类标记，对上述群体亲本和单株进行扩增，构建初步遗传图谱，进行初 步定位。根据初步定位结果，参考已测序的马铃馨基因组序列，在定位的区段内设计相应的 引物，通过测序找出差异片段设计引物，用于检测群体后代中该基因的差异。
[0076] PCR扩增体系（2化1)如下：DNA模板（SOngAil)化1，上下引物（IOiiM)各0.扣1，化aq PCR Mix(2X)10山，d地2〇祉IJCR反应程序也采用Touchdown PCR程序：95°C预变性3min， 然后12循环依次经过95°C变性lmin、Ta°C (每循环减少0.5°〇1111111、72°(：延伸11111113〇3，随后 23循环依次经过95°C变性lmin、Ta-6°C退火lmin、72°C延伸lmin30s，最后72°C延伸5min。其 中CAPS标记酶切所用的酶包括AluI、A化I和化ql，均由化kara公司提供，酶切体系如表7所 /J、- O
[0077] 表7酶切体系
[007引
[0079] 扩增产物检测流程同AFLP。
[0080] 3、遗传图谱构建
[0081] SS財示记和特异区段标记读带是先用相机对聚丙締酷胺凝胶电泳后的胶片进行拍 照，利用照片进行读带，首先按照点样顺序逐条对多态性条带进行多态性比对，有差异的条 带出现记为1，不出现记为0,不易辨认或缺失的记为"-";AFLP的带型记录是将银染后的胶 板放置在白光灯箱上直接读带，方法同SSR。利用Quan 1 ity one(Bio-rad，USA)计算扩增片 段的分子量大小。将所有带型录入Excel,并对多态性位点进行命名，命名原则是引物名称 加上扩增片段大小，如S012_230表示SSR引物S012扩增的大小为23化P的多态性位点。
[0082] 连锁图谱的构建使用计算机软件化inmap 4(化n Ooijen 2006)，将所有分子标记 的带型按照该软件要求进行转换后导入软件，采用双拟测交策略（Grattapaglia and Sederoff 1994)，构建双亲的图谱化和B)。连锁群的划分采用independence LOD值，Stad 值设置为2.0，end值设置为10.0、St邱值设置为1.0，划分连锁群时LOD阔值为3.0。计算遗传 距离的函数为Kosambi函数。连锁群的编号和方向是根据已报道的SSR标记W及候选基因标 记的遗传定位信息来确定的，编号后加上B表示为父本5.66的]1曰1111:;[;[的连锁群，6表示为母 本邸25的连锁群。
[0083] 4、表型鉴定
[0084] EB群体的田间种植在由不同年份和不同地点组合而成的6个不同环境下进行， 2008年种植了S个地点，分别是长岭岗（109.8E，30.2N)、天池山（109.7E，30.3N)和武汉 (114.4E，30.5N) ,2010年的种植点为武汉，2012年分别在天水（105.6E，34.6N)和武汉种植， 田间试验设计采用顺序排列法，每个基因型3个重复，每重复种植10株。
[0085] 在收获后的块茎中选取无病虫害、较大的馨块9-15个，室溫放置7天后分别进行如 下3个处理后：1)测定块茎中的还原糖含量，即收获后还原糖含量(Od) ;2)将馨块4°C胆藏 30d后测定块茎中还原糖含量，即低溫糖化后还原糖含量(4°C30d);3)将低溫处理30d后的 馨块，转入室溫放置20d后测定还原糖含量，即回暖后还原糖含量。邸群体田间实验设计和 块茎处理方式如表8所示。
[00化]表8邸群体田间实验设计和块茎处理方式
[0087]
[0088] a"-"数据缺失;b4°C30d，低溫胆藏30d;c Rec，室溫回暖20d。
[0089] 还原糖含量的测定方法如下：
[0090] 用打孔器取馨块的不同部位，并将其切成薄片后称重，然后用真空冻干机动冻干 后称干重，计算干鲜重比。称取冻干后的干粉约15mg与1.5ml离屯、管中，加入80%酒精提取 液lml，80°C水浴60分钟，13000r/min离屯、9min后将上清液倒入另一 1.5ml离屯、管，将含有上 清液的离屯、管放在80°C恒溫干浴器中，将酒精蒸发掉，待酒精蒸发完后加20化1蒸馈水，摇 匀后放入55°C烘箱30min充分溶解还原糖，然后取样品溶液于PCR板，加入事先配好的 DNS溶液离屯、PCR板至充分下沉，然后将PCR板盖上盖子后置于95 °C干浴器上加热5min， 反应完成后立即用冰快速冷却，再加蒸馈水16化1，混匀后取10化1至酶标板用全自动酶标 仪化LxSOOO)测定540nm波长下的吸光值。用不同浓度的葡萄糖标准液(0-5mg/ml)，与样品 相同的反应体系做标准曲线，根据标准曲线计算样品中还原糖的浓度。
[0091] 5、低溫糖化相关性状的OTL定位和位点间的互作分析
[0092] QTLs定位软件义用的是MapQ^ 6(化n Ooi jen 2009)，首先通过F*e;rmu1:ationTest (1000次迭代)来估计不同环境和处理组合在a = 0.05水平上的LOD阔值，然后使用区间作图 法（IM)找到确定的QTLs和与其紧密连锁的标记，W紧密连锁的标记为Cofactor用于多模型 作图(mutiple Q化model，MQM)检测。IM和MQM均WlcM的步长扫描整个基因组，W连锁群上 LOD值最大的位置作为WL的位置。Q化的名称由CIS和亲本名化D或者Sb) W及染色体号组 成，同一染色体上不同的OTL用阿拉伯数字加 W区分。如果2个WL的2-L0D置信区间重叠，贝U 被视为一个QTL。连锁图谱和OTL的位置用MapChart 2.2(Voorrips2002)绘制。
[0093] 采用软件OTL化twork v2.2(化ng et al2007)结合表型对标记进行加性和上位性 互作分析。将邸群体中相斥连锁相的标记参照化islain et al(2001)中方法进行转换，转 换后按照回交群体进行分析，软件参数设置为默认值。上位性位点命名方式与用MapQTL 6 定位出的OTL的命名相似，只是在CIS后加上了I表示上位性QTL。
[0094] 然后分别进行QTL定位和加性效应位点的分析。共检测到4个具有加性效应的QTL， 分别是ClSSbOS-UQll的表示方法为性状名CI巧日连锁图编号Sb05加阿拉伯数字，其中Sb05 表示为父本5号染色体，阿拉伯数字为该染色体上WL的编号）、CISED06-l、CISED06-3和 CISED07-1，其对应的引物编号分别为S3002、S3001、S3003和S3004，具体如图2所示。
[00巧]实施例2
[0096] 对实施例1中筛选得到的4个分子标记进行验证
[0097] 本发明测定EB群体在3个不同环境（长岭岗（109.8E，30.2N)、天池山（109.7E， 30.3N)和武汉al4.4E，30.5N))中种植后块茎经过低溫胆藏后(4°C30d)的还原糖含量，还 原糖含量测定方法同实施例1;田间试验设计采用顺序排列法，每个基因型3个重复，每重复 种植10株。
[0098] 邸群体的嫩叶采用改良CTAB法提取基因组，具体步骤同实施例1。
[0099] 经检测，提取的基因组含量为50-200ngAU，然后分别WS3001-S3004核酸序列的 引物对进行降落PCR。
[0100] 各分子标记的降落PCR体系均为，具体如下:超纯水(d地2〇)1化1，自然群体的 基因组DNA化iaOXBuffer化1，浓度为IOmM的dNTPs 0.化1，浓度为IOiiM的上游引物0.化 1，浓度为1 OyM的下游引物0.化1，I^qDNA聚合酶0.化1。
[0101] 降落PCR扩增程序均为：95°C预变性3min;94°C变性3〇3,58°(：退火3〇3,72°(：延伸 Imin,循环11次，每次循环退火溫度降0.5°C;94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，循 环33次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0102] 分子标记为S3003，PCR扩增产物先采用Alu I酶酶切，酶切体系如下:扩增反应产 物IOiU,浓度为IUAU的Alu I酶0.扣1，10 XLBO.化1，超纯水(d地20)9.4山，37°C酶切化，保 存4 °C至取出进行检测；
[0103] 分子标记为S3004，PCR扩增产物先采用Afa I酶酶切，酶切体系如下:扩增反应产 物IOiU，浓度为IUAU的Afa I酶0.扣1，10 X LBO.化1，0.1 %B