专利名称：一种用于基因分析的荧光aflp试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种试剂盒，特别是涉及一种用于基因分析的荧 光AFLP试剂盒。
背景技术：
扩增片断长度多态性 (Amplified fragment length polymorphism, AFLP)标记技术是一种DNA指纹技术，主要用于检测 DNA多态性。AFLP技术是根据基因组DNA水平的差异进行检测，不受 组织和器官、发育阶段、生理条件等诸多因素影响，因此AFLP技术 具有广阔的前景，可作为种质鉴定、亲缘关系及种质分类研究的理想 标记。
实用新型内容
本实用新型需要解决的技术问题是提供一种用于基因分析的荧 光AFLP试剂盒，该种试剂盒能够用于基因分析，能够用于种质鉴定、 亲缘关系及种质分类研究，并具有数据收集自动化、定量化、灵敏性 更好、速度更快、效率更高等特点。
本实用新型解决技术问题可以通过采取如下技术方案
一种用于基因分析的荧光AFLP试剂盒，其特征是包括盒体、 六组试剂瓶，盒体内设有瓶架，各试剂瓶放置于瓶架上；第一组试剂 瓶为装有适配子的试剂瓶；第二组试剂瓶为装有属于酶切/连接反应 预混合体系中的试剂的试剂瓶；第三组试剂瓶为装有PCR预混合体系 中的试剂的试剂瓶；第四组试剂瓶为装有预扩增引物预混合体系中的 试剂的试剂瓶；第五组试剂瓶为装有选扩增引物系列中的试剂的试剂 瓶；第六组试剂瓶为装有质控DNA的试剂瓶；其中，第五组试剂瓶设 有荧光物质。本实用新型解决技术问题还可以进一步采取以下改进
第一组试剂瓶共为一瓶，第二组试剂瓶共为二瓶，第三组试剂瓶 共为四瓶，第四组试剂瓶共为一瓶，第五组试剂瓶共为十六瓶，第六 组试剂瓶共为一瓶。
所述盒体由外盒与内盒组成，外盒的一个侧面敞开；内盒与外盒 的大小匹配，内盒置于外盒内，内盒的顶面敞开；瓶架置于内盒内。
所述瓶架上设有瓶孔，各试剂瓶置于相应的瓶孔内。
本实用新型具有以下技术效果
本实用新型试剂盒能够用于基因分析，能够用于种质鉴定、亲缘 关系及种质分类研究。试剂盒使用方便、结构简单，里面放置的各种 试剂瓶数量合理，摆放有序，便于进行各种基因分析。本试剂盒在选 择性扩增引物的5'端标记上了荧光物质(本试剂盒标记6-FAM，发 蓝色荧光)，在测序仪上电泳时，由于激光的激发产生不同波长的荧 光，能被测序仪自动收集生成图像信号，在有分子量内参marker(红 色荧光)的前提下，信号可以转换成一定分子量大小的片段，具有数 据收集自动化、定量化、灵敏性更好、速度更快、效率更高等特点。
图1是本实用新型试剂盒示意图。
图2是本实用新型试剂盒拉出内盒时的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本实用新型进行具体描述。
如图1、图2所示， 一种用于基因分析的荧光AFLP试剂盒，包 括盒体、六组试剂瓶，盒体内设有瓶架1，各试剂瓶放置于瓶架1上。 所述盒体由外盒2与内盒3组成，外盒2的一个侧面敞开；内盒3与 外盒2的大小匹配，内盒3置于外盒2内，内盒3的顶面敞开；瓶架 1置于内盒3内。所述瓶架1上设有瓶孔4，各试剂瓶置于相应的瓶孔4内。第一组试剂瓶5为装有适配子(Adaptor)的试剂瓶；第二组 试剂瓶6为装有属于酶切/连接反应预混合体系(RLmix)中的试剂的 试剂瓶；第三组试剂瓶9为装有PCR预混合体系(PCRmix)中的试剂 的试剂瓶；第四组试剂瓶8为装有预扩增引物预混合体系(Pr印mix) 中的试剂的试剂瓶；第五组试剂瓶10为装有选扩增引物系列(Selprim) 中的试剂的试剂瓶，其中包括Selprim-M系列和Selprim-E系列；第 六组试剂瓶7为装有质控DNA (ControlDNA)的试剂瓶；其中，第五组 试剂瓶设有荧光物质。
第一组试剂瓶5共为一瓶，第二组试剂瓶6共为二瓶，第三组试 剂瓶9共为四瓶，第四组试剂瓶8共为一瓶，第五组试剂瓶10共为 十六瓶，第六组试剂瓶7共为一瓶。
本实用新型试剂盒能够用于基因分析，能够用于种质鉴定、亲缘 关系及种质分类研究。试剂盒使用方便、结构简单，里面放置的各种 试剂瓶数量合理，摆放有序，便于进行各种基因分析。
AFLP的基本原理是基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成 分子量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的、人工合成的、短 的双链接头连在这些片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过 接头序列和PCR引物3'端选择性碱基的识别，对特异性片段进行预 扩增和选择性扩增。最后只有那些两端序列能与选择性碱基配对的限 制性酶切片段才能被扩增；最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性 聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。
荧光AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) 原理与常规AFLP相同，但在选择性扩增引物的5，端标记上了荧光 物质(本试剂盒标记6-FAM,发蓝色荧光)，在测序仪上电泳时，由 于激光的激发产生不同波长的荧光，能被测序仪自动收集生成图像信 号，在有分子量内参marker (红色荧光)的前提下，信号可以转换 成一定分子量大小的片段，具有数据收集自动化、定量化、灵敏性更 好、速度更快、效率更高等特点。本方法将最新的毛细管电泳技术(ABI 3130XL遗传分析系统) 与荧光AFLP相结合，与传统的直板电泳相比，具有明显优势片段 大小全数字化，波动范围在土lbp,方便比对并根据峰高和品系背景 对片段作出合理的取舍；对于低分子量区片段的分析优势独有，直板 电泳在低分子量区带型堆积，肉眼很难分辨，不同的分析者判断主观 性强，结果偏差大，有时不得不放弃大量的多态性信息，而 genemapper3. 5软件会智能化过滤噪音信号，避免了肉眼判带的主观 性，在低于100bp的区域，尤其是60bp左右的区域能获得大量的多 态性信息；实验中每个样品孔中均加入分子量marker，实现了片段 大小的高度均一化，孔间(样本间)及板间(批次间)高度可比性， 避免了直板电泳的缺点(每板只有一个marker泳道，板内尚容易出 现偏差，板间更难客观比对，只能根据主观经验判读)。
1).本试剂盒为Msel/EcoRI组合模式，其中酶切/连接反应为一 步完成，为保证AFLP实验的准确性、减少片段丢失，请检测基因组 DNA的纯度及完整性。建议常规方法提取基因组总DNA，溶解为浓度 50ng/ul。 2).本试剂盒组分常温下不稳定，请勿反复冻融，长期不 使用请于-80'C低温保存。3).为确保实验成功，请连续完成实验步 骤中的各个实验过程，尽量不要在单个实验环节完成后长期冻存中间 产物。
使用本试剂盒时请按以下操作步骤进行， 操作步骤
1.酶切/连接反应(20ul反应体系) 在20lil反应体系中，含有以下成份 RLmix 17ul Adaptor lul 模板DNA (50ng/ul) 2ul 按以下条件进行酶切/连接反应37°C 5小时+ 15'C 5小时，4'C保存备用.
*为确保酶切完全，RLmix分装前请充分混匀；模板DNA含量请 勿超过200ng;酶切时间可以酌情增减。
2.预扩增反应(20ul反应体系) 在20ul反应体系中，含有以下成份
PCR mix
17ul
Prepmix lul template DNA (连接反应产物) 2ul 按以下条件进行预扩增PCR反应-
94。C 2 min
94°C 30sec —55。C 30sec —72。C 80sec共30 cycle
72。C 5 min
4°C保存
*为确保扩增效率，PCR mix分装前请充分混匀
3.选择性扩增反应(20ul反应体系): 在20ul反应体系中，含有以下成份
PCR mix
Selprim-E (6-FAM荧光标记)
Selprim-M
template DNA (预扩反应产物20X稀释后)
17ul 0. 5 ul 0. 5ul
2ul
按以下条件进行预扩增PCR反应94。C 2 min
94。C 30sec —65。C 30sec —72。C 80sec —touchdown to 55。C by 10 cycle —
94°C 30sec —55°C 30sec —72。C 45sec —24 cycle
72。C 5 min
4'C保存
*为确保扩增效率，PCR mix分装前请充分混匀。 4.片段分析
本试剂盒选择性扩增产物可用于多种片段分析方法，推荐使用 ABI 3730测序仪或同类型仪器进行全自动数字化片段分析。
附选择性扩增引物系列
Selprim-M浓度(uM)Selprim-E (6-FAM荧光标记)浓度
M"CAA10E國ACA5
M-CAT10E-ACT5
M-CAC10E-ACC5
M-CAG10E-ACG5
M-CTA10E陽AAC5
M-CTTioE-AAG5
M-CTC10E-AGC5
M-CTG10E-AGG权利要求1、一种用于基因分析的荧光AFLP试剂盒，其特征是包括盒体、六组试剂瓶，盒体内设有瓶架，各试剂瓶放置于瓶架上；第一组试剂瓶为装有适配子的试剂瓶；第二组试剂瓶为装有属于酶切/连接反应预混合体系中的试剂的试剂瓶；第三组试剂瓶为装有PCR预混合体系中的试剂的试剂瓶；第四组试剂瓶为装有预扩增引物预混合体系中的试剂的试剂瓶；第五组试剂瓶为装有选扩增引物系列中的试剂的试剂瓶；第六组试剂瓶为装有质控DNA的试剂瓶；其中，第五组试剂瓶设有荧光物质。
2、 根据权利要求l所述的一种用于基因分析的荧光AFLP试剂盒， 其特征是第一组试剂瓶共为一瓶，第二组试剂瓶共为二瓶，第三组 试剂瓶共为四瓶，第四组试剂瓶共为一瓶，第五组试剂瓶共为十六瓶， 第六组试剂瓶共为一瓶。
3、 根据权利要求l所述的一种用于基因分析的荧光AFLP试剂盒， 其特征是所述盒体由外盒与内盒组成，外盒的一个侧面敞开；内盒 与外盒的大小匹配，内盒置于外盒内，内盒的顶面敞开；瓶架置于内 盒内。
4、 根据权利要求l或2或3所述的一种用于基因分析的荧光AFLP 试剂盒，其特征是所述瓶架上设有瓶孔，各试剂瓶置于相应的瓶孔 内。
专利摘要本实用新型公开了一种用于基因分析的荧光AFLP试剂盒，包括盒体、六组试剂瓶，盒体内设有瓶架，各试剂瓶放置于瓶架上；第一组试剂瓶为装有适配子的试剂瓶；第二组试剂瓶为装有属于酶切/连接反应预混合体系中的试剂的试剂瓶；第三组试剂瓶为装有PCR预混合体系中的试剂的试剂瓶；第四组试剂瓶为装有预扩增引物预混合体系中的试剂的试剂瓶；第五组试剂瓶为装有选扩增引物系列中的试剂的试剂瓶；第六组试剂瓶为装有质控DNA的试剂瓶；其中，第五组试剂瓶设有荧光物质。试剂盒使用方便、结构简单，本实用新型试剂盒能够用于基因分析，能够用于种质鉴定、亲缘关系及种质分类研究。具有数据收集自动化、定量化、灵敏性更好、速度更快、效率更高等特点。
文档编号G01N21/64GK201381320SQ20092005173
公开日2010年1月13日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者张宏斌, 钦 范 申请人:广州华灿医药科技有限公司