快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法与流程

本发明涉及转基因油菜、大豆等作物的谷物散粮及其粗加工产品中的蛋白CP4-EPSPS的快速检测方法，属于转基因检测领域。

背景技术：

随着各种各样的转基因食品大量涌入市场，转基因食品的安全性日益备受关注，世界各国对转基因食品的安全性存在较大的争议。欧盟，日本等地区已制定相关法规对转基因食品进行严格的管理。因此，快速检测转基因作物/植物中转基因蛋白的方法具有重要的意义。

自1996年孟山都(Monsato)公司上市第一例抗草甘膦大豆一来，转基因作物的推广应用经历了18年，抗除草剂性状仍然是转基因植物的首要性状。CP4EPSPS被应用于多种作物的转基因研究中，包括玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜和苜蓿等。

随着各种各样的转基因食品通过贸易大量进入国际市场，转基因食品的安全性受到人们的日益关注，世界各国对转基因食品的安全性存在着较大的争议，欧盟、日本等地区已经制定了相关法规对转基因食品进行了严格的管理。因此，检测转基因作物/植物中转基因蛋白的定量技术逐渐成为研究热点之一。

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是莽草酸合成途径中的关键酶，能够催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与莽草酸-3-磷酸(SP3)生成5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)，为芳香族氨基酸的合成提供前提物质，该酶广泛存在于微生物和高等植物体内。除草剂草甘膦的靶标酶即为EPSPS。来自根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS对高浓度的草甘膦表现出非常高的抗性，从此，该基因被广泛用于多种转基因作物中。

目前常用的CP4-EPSPS检测方法包括基于DNA的PCR检测方法及基于蛋白质的酶联免疫吸附法。PCR法能够从作物种子开始到作物成熟整个过程中对转基因成分进行精确检测，不受样品的处理方法的影响，但易出现假阳 性和假阴性等问题，且因经高度处理过的转基因产品及其衍生物，如植物油、糖或者淀粉等中不含任何DNA成分，因此PCR方法无法实现对此类转基因食品的检测。酶联免疫吸附法可对样本进行批量处理，但其耗时较长，需要专业技术人员，且需特殊的仪器，因此该种检测方法不利于在无相关专业技术用户市场的推广和使用。本发明采用胶体碳免疫层析技术，可实现快速检测，肉眼即可进行判断，无需专业技术人员的便于推广的目的。

技术实现要素：

针对上述情况，本发明提供一种利用胶体碳建立的快速检测转基因作物(油菜、大豆等)的谷物散粮及其粗加工产品中的CP4-EPSPS的检测试纸条，采用标记了兔多克隆抗体E01的胶体碳垫与包被了兔多克隆抗体C01的硝酸纤维素膜(检测线)和包被了羊抗兔IgG的硝酸纤维素膜(质控线)制成硝酸纤维素膜配合；采用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和硝酸纤维素膜的检测线上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进行结果的判定，它具备操作简便，迅速，反应灵敏度高，成本低以及便于大规模推广使用的优点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，包括以下步骤：

步骤一，胶体碳的制备；

步骤二，适合PH值条件下胶体碳标记抗体的制备；

步骤三，抗体包被至反应膜作为T线及二抗包被至反应膜的C线；

步骤四，胶体碳试纸条的制备；

步骤五，从待检植物中提取蛋白，制备蛋白提取液；

步骤六，将检测试纸条插入蛋白提取液中反应；

步骤七，适当反应时间后，进行肉眼判断结果。

优选的，步骤二中所述抗体为兔抗CP4-EPSPS多克隆抗体；优选的，步骤二中PH值为8～10，最优选的PH值为9.0。

优选的，步骤三中所述抗体亦为兔抗CP4-EPSPS多克隆抗体。

优选的，步骤三中抗体包被量为100ug/1ml碳。

优选的，步骤三中所述二抗为羊抗兔IgG抗体。

优选的，步骤六中所述反应温度为10℃～30℃，更优选15℃-25℃。

优选的，步骤七中所述反应时间为3-15分钟，更优选5-10分钟。

本发明的优点是：采用胶体碳免疫层析技术，可实现快速检测，肉眼即可进行判断，无需专业技术人员的便于推广的目的。采用胶体碳检测试纸条，制备出表面带有游离氨基基团的胶体碳纳米颗粒，胶体碳相对胶体金具备一系列优越性：胶体碳较胶体金更易制备，更易实现规模化生产且批间差小；胶体碳黑白信噪比更高，而胶体金红白对照不易辨别且易受全血检测的影响；检测动力学范围更广，大大降低了胶体金易出现的HOOK效应的可能性；较胶体金更稳定，可于室温下保存更久；固态碳对环境友好，避免了胶体金技术出现的环境重金属污染的情况。快速检测转基因植物中转基因蛋白采用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和NC膜检测线上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进行结果的判定。

一种CP4-EPSPS胶体碳快速检测试纸条，其特征在于，包括PVC底板、样品垫、硝酸纤维素膜、质控线、检测线、吸水滤纸，PVC底板一侧设有样品垫，另一侧设有吸水滤纸；样品垫和吸水滤纸之间设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜右侧卡接在吸水滤纸中；所述硝酸纤维素膜中部设有检测线和质控线，检测线靠近样品垫，还包括胶体碳垫，所述胶体碳垫为包被兔多克隆抗体E01的胶体碳垫，样品垫右端与胶体碳垫搭接相连，胶体碳垫右侧与硝酸纤维素膜搭接相连。

一种CP4-EPSPS胶体碳快速检测试纸条的使用方法，包括以下步骤：

一、样本处理：

a)称取待测谷物样品至带有盖子的反应容器中；

b)利用搅拌机或其它类似设备将谷物打碎成细颗粒状；

c)依据样品总质量加入相应体积的超纯水或去离子水，其中水的体积(毫升)为样品总质量(克)的4～6倍；

d)拧紧反应容器的盖子，上下振荡至少30～60秒，确保样品与超纯水 或去离子水充分混匀；

e)静置至反应容器中固体物质沉降；

二、样本检测：

a)用吸管吸取反应容器中上清液加入样品杯，直至样品杯中上清液加满至基准线，保证样品杯中的上清液中没有颗粒物；

b)静置30～60秒后，将样品杯中的上清液滴入快速检测试纸条的加样区，即可开始测试；

三、结果判断：

当上清液为阴性(-)时：检测线(T线)不显色；当上清液为阳性(+)时：检测线(T线)显黑色、肉眼可见；当未出现质控线(C线)，可能操作不当或试纸已失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸重新测试。

优选的，步骤一c)中加入的超纯水或去离子水为样品总质量的5倍。

优选的，步骤一d)中振荡时间为30秒。

优选的，步骤二a)进行之前，将反应器中混合液于离心机(日立离心机，CF16RXII)中1000rpm离心5分钟。

优选的，步骤二b)中静置时间为30秒。

本发明的优点是：采用标记了多克隆抗体E01的胶体碳垫与包被了多克隆抗体E01的硝酸纤维素膜(检测线)和包被了羊抗兔IgG的硝酸纤维素膜(质控线)制成检测试纸条；采用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和硝酸纤维素膜的检测线上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进行结果的判定。本检测试纸采用胶体金标记，较胶体金制备更简单难，黑白信噪比更低，且不易受全血检测的影响，不易出现的HOOK效应，稳定且易保存，且成本较低。综上所述，本检测试纸条具备操作简便，迅速，反应灵敏度高，成本低以及便于大规模推广使用的优点。

附图说明

图l为本发明的结构示意图。

图2为本发明检测转基因油菜籽的检测结果。

图3为本发明检测转基因大豆的检测结果。

在图中：1-PVC底板，2-样品垫，3-硝酸纤维素膜，4-质控线，5-检测线，6-吸水滤纸，7-胶体碳垫，8-加样区。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

参见图1～图3，一种快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，包括以下步骤：

步骤一，胶体碳的制备；

步骤二，适合PH值条件下胶体碳标记抗体的制备；

步骤三，抗体包被至反应膜作为T线及二抗包被至反应膜的C线；

步骤四，胶体碳试纸条的制备；

步骤五，从待检植物中提取蛋白，制备蛋白提取液；

步骤六，将检测试纸条插入蛋白提取液中反应；

步骤七，适当反应时间后，进行肉眼判断结果。

优选的，步骤二中所述抗体为兔抗CP4-EPSPS多克隆抗体；优选的，步骤二中PH值为8～10，最优选的PH值为9.0。

优选的，步骤三中所述抗体亦为兔抗CP4-EPSPS多克隆抗体。

优选的，步骤三中抗体包被量为200ug/1ml碳。

优选的，步骤三中所述二抗为羊抗兔IgG抗体。

优选的，步骤六中所述反应温度为10℃～30℃，更优选15℃-25℃。

优选的，步骤七中所述反应时间为3-15分钟，更优选5-10分钟。

作为优选实施例，步骤一胶体碳的制备方法具体为：

1、向100g碳粉中加入超纯水，定容至500ml，搅拌溶解30分钟后离心(12000g，30分钟)，收集上清于干净的烧杯中；

向步骤1的溶液中加入0.5g十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)，并定容至500ml，即溶液中碳粉的终浓度(质量体积比)为20％，CTAB的终浓度(质量体积比)为0.1％；

2、将步骤2所得溶液进行超声破碎：超声变幅杆Φ6，输出功率60％，超声开时3秒，关时3秒，总时长5分钟(宁波新芝超声波细胞粉碎机，Scientz-IID)，使之成为悬浮状的胶体碳纳米颗粒溶液；电镜下观察，颗粒直径覆盖范围由数十纳米至数百纳米不等；

3、向步骤3所得溶液中加入100ml的无水乙醇，充分搅匀后，加入10ml硅烷化试剂(购于Thermo公司，货号48927)，搅拌速度200转/分钟，通入氮气情况下，55℃反应8小时；待反应结束后，用无水乙醇清洗3～5次，然后再用0.02M PBS(PH7.4)缓冲液洗涤3～5次，至此，制备完成表面带有游离氨基基团的胶体碳纳米颗粒。

作为优选实施例，步骤二适合PH值条件下胶体碳标记抗体的制备具体方法为：

1、胶体碳最适PH值确定

向一系列不同PH值梯度的硼酸盐缓冲液中先后加入0.1％纳米碳悬液及0.1％TritonX-100。超声处理(300W，超声6秒停4秒，工作80个循环)上述混合液后，200rpm离心10分钟，收集上清并静置24小时后，观察无沉淀者即为最适PH值。本发明中，PH9时，胶体碳最为稳定，无沉淀，因此PH 9作为标记抗体最适PH值。

2、多克隆抗体的胶体碳标记

向800ul 0.02M硼酸缓冲液(PH9.0，下同)中加入200ul抗CP4-EPSPS多克隆抗体E01(购买于华葵金配公司，1mg/ml)，涡旋振荡混匀。向上述混合液中加入20ul 1.5％(质量体积比)EDC溶液，于室温条件下旋转震荡20分钟；向上述混合液中加入200ul实施例所制备胶体碳纳米颗粒，于恒温摇床中300转，25℃放置2小时；向上述混合液中加入100ul含20％BSA的硼酸缓冲液，继续于恒温摇床中300转，25℃放置5小时；于12000g离心20分钟，留取沉淀，0.02M硼酸缓冲液反复重悬-离心，洗涤4次；最终，1ml 0.02M硼酸盐缓冲液重悬沉淀并于超声破碎仪(宁波新芝超声波细胞粉碎机，Scientz-IID)中，超声分散输出功率60％，超声开时3秒，关时3秒，总时长5分钟；至此，即得胶体碳标记的CP4-EPSPS抗体，置于4℃保存备用。

作为优选实施例，CP4-EPSPS胶体碳快速检测试纸条的制备方法具体为：

本发明检测试纸条采用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和NC膜检测线上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进行结果的判定。具体步骤包括：

1、制备用胶体碳标记的CP4-EPSPS抗体E01。

2、碳标垫及反应膜的制备：

按照1∶100比例稀释胶体碳标记的兔抗CP4-EPSPS多克隆抗体E01，喷涂于胶体碳垫上，干燥后备用；按照1∶8000比例稀释多克隆抗体E01(初浓度为1mg/ml，购买于华葵金配公司)及1∶10000比例稀释羊抗兔IgG(初浓度为1mg/ml)后分别包被于硝酸纤维素膜的T线及C线位置，干燥后备用。3、贴膜及切膜：

从左向右依次将样品垫，胶体碳垫，硝酸纤维素膜，吸水滤纸依次贴附于PVC底板上且相互之间依附搭接相连。完成之后将试纸切割成宽3mm的试纸条成品。

一种CP4-EPSPS胶体碳快速检测试纸条的使用方法，包括以下步骤：

一、样本处理：

a)称取待测谷物样品至带有盖子的反应容器中；

b)利用搅拌机或其它类似设备将谷物打碎成细颗粒状；

c)依据样品总质量加入相应体积的超纯水或去离子水，其中水的体积(毫升)为样品总质量(克)的4～6倍；

d)拧紧反应容器的盖子，上下振荡至少30～60秒，确保样品与超纯水或去离子水充分混匀；

e)静置至反应容器中固体物质沉降；

二、样本检测：

a)用吸管吸取反应容器中上清液加入样品杯，直至样品杯中上清液加满至基准线，保证样品杯中的上清液中没有颗粒物；

b)静置30～60秒后，将样品杯中的上清液滴入快速检测试纸条的加样区，即可开始测试；

三、结果判断：

当上清液为阴性(-)时：检测线(T线)不显色；当上清液为阳性(+)时：检测线(T线)显黑色、肉眼可见；当未出现质控线(C线)，可能操作不当或试纸已失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸重新测试。

优选的，步骤一c)中加入的超纯水或去离子水为样品总质量的5倍。

优选的，步骤一d)中振荡时间为30秒。

优选的，步骤二a)进×行之前，将反应器中混合液于离心机(日立离心机，CF16RXII)中1000rpm离心5分钟。

优选的，步骤二b)中静置时间为30秒。

本发明CP4-EPSPS快速检测试纸条的性能评价：

(1)将本发明所述CP4-EPSPS快速检测试纸条分别检测MS8×RF3×GT73杂合油菜籽(图2，A(100％)、B(5％)、C(1％))及非转基因油菜籽(图2，D)，可见本发明可有效区分转基因及非转基因油菜籽，且随着转基因成分的增加，检测结果逐渐增强。

将本发明所述CP4-EPSPS快速检测试纸条分别检测RRS抗草甘膦转基因大豆(图3，A(5％)，B(1％))及非转基因大豆(图3，C)，可见本发明可有效区分转基因及非转基因大豆，且随着转基因成分的增加，检测结果逐渐增强。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。