一种用于检测乳腺癌的试剂盒的制作方法

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种用于检测乳腺癌的试剂盒。

背景技术：

her-2/neu基因，又名c-erbb2，定位于人染色体12q21，编码相对分子质量约为18500的跨膜糖蛋白p185，p185包含1225个氨基酸残基，由信号肽、胞外区、跨膜区及胞内区4个部分组成。在乳腺、卵巢、肺、胃、前列腺等10余种癌症中均显示部分患者有过量表达，作为一个重要的肿瘤表面标志蛋白，尤其对乳腺癌，已被国际公认是重要的临床指标。目前，国内外已有上市的免疫组化试剂盒和药物用于检测和靶向治疗乳腺癌。美国《基因》杂志(gene，1995.159：19-27)综述大量临床研究结果后指出，当细胞膜p185neu/c-erbb-2高表达即over-expression时，说明该肿瘤的恶性程度高，术后易发生转移和复发。因此制备临床诊断肿瘤组织中p185表达水平的单克隆抗体具有很重要的意义。

目前，国内外针对p185主要制备的单克隆抗体授权的专利有很多，比如cn1118568c中公开的抗p185neu/c-erbb-2单克隆抗体杂交瘤a18、a21和a22所分泌的抗体a18、a21和a22，用于检测肿瘤组织上p185neu/c-erbb-2的表达水平，其单抗的特异性强，阳性染色为膜着色，背景低，适宜用于临床病理切片的免疫组化检测，也可能发展到病人血清的检测。

cn1238381c针对肿瘤表面抗原p185的单链抗体-人scfv-fc嵌合抗体及其制备方法，特征是采用表面表位包埋法免疫后制备的杂交瘤细胞株，以单链嵌合抗体基因的形式转染哺乳动物细胞cho，采用pee14作为重组抗体的载体，用它携带基因转染到gs低表达的哺乳动物细胞cho中，将高表达重组抗体的cho细胞株筛选出来；本发明的嵌合抗体分子仅由两条相同的重组单链组成，每条重组单链有一的抗原结合区，由重链和轻链可变区共价连接在一起，构成了识别抗原的单链抗体；由于去除了轻链恒定区和重链恒定区的ch1结构域，比完整抗体的分子量小了近三分之一，既更容易透过血管系屏障渗透进实体瘤的内部，又不像小的蛋白多肽药物那样容易很快被降解，从而能更好地发挥抑制肿瘤生长的作用。

目前最常用的p185蛋白检测方法有酶联免疫吸附测定elisa，荧光原位杂交fish以及免疫组化学法ihc。其中elisa法简单、敏感，但是制备单克隆抗体比较复杂。fish法灵敏度更高，因dna的相对稳定而使检查结果可靠，但是价格昂贵，技术复杂。ihc相对而言，是目前检查her-2蛋白水平最常用的方法，但是基于对照高表达组织的来源以及数量有限，不适宜大规模使用，导致肿瘤蛋白在筛查，复查，控制预后方面的临床应用受限。

目前在医药市场上，针对p185相关的her2相关的单抗已经在国内外上市，具有巨大的市场空间。基于单克隆抗体研发的高投入以及不稳定性，为了开拓国内的市场，研发新的能够特异性结合p185的相关抑制剂及检测剂变得尤其具有市场价值。

根据蛋白的空间结构设计多肽，从而在三维结构上抑制蛋白的功能是目前研究的热点，并且也有多个产品已经上市。基于p185抗体研究的高投入和不确定性，针对p185的特异性抑制肽或结合肽的研究也是一个新的研究方向。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明人经过大量试验和艰辛的劳动发现了一种短肽抑制剂，其对p185具有显著的抑制作用，可用作治疗和/或预防与p185有关的疾病的药物活性成分。因此，本发明的目的在于提供一种短肽抑制剂及其用途。

为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案:

一方面提供了一种抑制肽的计算机辅助设计获得方法，所述计算机软件是申请人自主开发设计的peptidedesigner，所述设计方法为设置长度为25-150个氨基酸的随机短肽使其在p185蛋白分子表面游走，并通过电荷改变肽段与p185的相对位置，快速计算该肽段上各个原子和蛋白表面相邻原子的作用力，以及移动、扭转肽段产生的能量变化；并反复优化比较各种可能的结合方式，选择能量最低的，做为定构象。依据相互作用原子的距离和空间关系得出多肽同p185分子的结合位点、参与的原子基团以及作用方式，最终筛选得到16个结合性和抑制性最高的抑制肽序列，采用生物实验最终确定2个抑制肽具有最好的抑制效果。

在另外一方面，本发明提供一种短肽抑制剂，其序列中为seqidno:1所示的氨基酸序列。

优选地，所述短肽抑制剂的序列在n段采用酰胺化修饰，c端连接聚乙二醇修饰。

本发明另外一方面，提供一种抑制肽-纳米颗粒复合系统，通过以下方式制备与修饰的:

(1)抑制肽:通过fmoc/叔丁基策略和hobt/tbtu/nmm偶联的方法化学合成制备(也可直接由生物公司合成)；

(2)60nm金纳米微球的合成:利用梓檬酸钠还原法一步合成18nm金颗粒；

(3)金纳米棒的合成:利用种子生长法合成金纳米棒；

(4)纳米金颗粒的表面多肽修饰；

(5)修饰后纳米金颗粒的表征:经修饰的金颗粒的物理化学性质可通过测量其光谱以及zeta-电势来表征。

在又一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗pd-1抑制剂，以及可药用载体。

在又一个方面，本发明提供了用于在有需要的对象中治疗或预防癌症或感染性疾病的方法，其包括将本发明的多肽/或药物组合物施用给所述对象。

在又一个方面，本发明提供一种肿瘤蛋白p185检测试剂盒，其特征在于:包括肿瘤蛋白p185结合肽、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白p185结合肽包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白p185结合肽和生物素标记的肿瘤蛋白p185结合肽。

其中，所述的洗涤液是由28.5g的na2hpo4.12h2o、80g的nacl、3.9g的nah2po4.2h20和50ml的tween-20加入纯化水溶解定容至1000ml所得。

另外一方面，所述的显色底物包括显色液a和显色液b，所述的显色液a是用柠檬酸缓冲液将30％过氧化氢稀释1000倍所得，所述的显色液b为用含20％二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液将四甲基联苯胺配制成0.4mg/ml所得。

另外一方面，所述的终止液是浓度为2mol/l的硫酸溶液。

另外一方面，所述的阳性对照品、阴性对照品分别为人体的p185阳性血清、p185阴性血清。

本发明的积极进步效果在于：本发明所述的多肽其与p185蛋白具有高度亲和力(亲和力kd<1×10^-12m)，能够结合p185蛋白胞外区，并能够在蛋白水平和细胞水平有效封闭p185蛋白，阻止p185蛋白与目的蛋白的结合。所述的多肽具有良好的生物活性。该多肽可以单独或与抗p185单克隆抗体或其它抗肿瘤药物联合的肿瘤免疫治疗和肿瘤病人的诊断和筛查中，即能够运用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等药物的制备中。

附图说明

图1是肿瘤体积和p185-1用药时间关系图。

图2是肿瘤体积和单抗用药时间关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。

实施例一:抑制肽的获得

发明人根据自己设计的抑制肽的计算机辅助设计方法peptidedesigner来设计相应的抑制肽，所述设计方法为设置长度为25-150个氨基酸的随机短肽使其在p185蛋白分子表面游走，并通过电荷改变肽段与p185的相对位置，快速计算该肽段上各个原子和蛋白表面相邻原子的作用力，以及移动、扭转肽段产生的能量变化；并反复优化比较各种可能的结合方式，选择能量最低的，最为定构象。依据相互作用原子的距离和空间关系得出多肽同p185分子的结合位点、参与的原子集团以及作用方式，最终筛选得到16个结合性和抑制性最高的抑制肽序列，采用生物实验最终确定2个抑制肽具有最好的抑制效果。其它14个效果不是特别突出的在此不一一列举。具有较好抑制效果的多肽序列p185-1为：rtaaprfspptlwmpqvhnqwrpvsfmfiivmvwqwapcwpaerllhssqrhphtpehsqsmtahpwfwfdersgqythyrmpftqgqtteresphnyhkrnhpahqr。其中下划线的三处为特异性结合与p185的蛋白的胞外区，在第25位氨基酸与第74位氨基酸之间形成二硫键。

实施例2抑制肽对p185的亲合力的测定

(1)将多肽(上海生工化学合成制备)用1×pbs配置成浓度为1mg/ml的溶液、将抗p185的多肽配置成100μg/ml的溶液，取2.5μl将其滴在羧基化的spr芯片(购自plexera公司，kx5型spr标配基底)上，通过链霉亲合素和生物素的特异性反应将多肽固定在spr芯片上。而后依次将浓度为0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml的p185溶液(1×pbs稀释)作为流动相通过芯片表面，结合时间150s，解离时间130s，重生时间200s。以1×pbs作为解离溶液，以0.5％磷酸作为重生液。在k×5型spr仪(plexera)上记录多肽与tnf-α的结合解离曲线。

(2)以langmuir公式拟合所述多肽与p185的spr曲线。经计算可以获得平衡结合/解离常数。所述多肽p185-1与p185的平衡解离常数kd值为0.77×10^-12m，表明多肽与p185的结合能力很强。

实施例3检测试剂盒的制备

1、肿瘤蛋白p185检测试剂盒的制备

1)常规器材及试剂的准备：

96孔酶标板、p185阳性血清、p185阴性血清、洗涂液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素w及显色液a、显色液b，其中p185阳性血清和p185阴性血清的符合率达100％。

2)包被96孔酶标板：

采用直接吸附法，用ph为9.6的pbs缓冲液将上述制备的p185-1多肽稀释至50μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在溫度为4℃的条件下放置过夜，然后用洗涂液洗涂，甩干，即得包被有所述多肽的96孔酶标板。

3)生物素化肿瘤蛋白p185多肽:

将上述制备的肿瘤蛋白p185-1与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，即得生物素标记的肿瘤蛋白p185多肽。

2、肿瘤蛋白p185检测试剂盒的使用步骤如下：

1)加样：

在包被有肿瘤蛋白p185-1的96孔酶标板上划分阳性对照孔、阴性对照孔、待测样品孔和空白孔共四组检测孔，阳性对照孔中加入p185阳性血清，阴性对照孔中加入p185阴性血清，待测样品孔中加入待测血清，三种样品的加入量均为100μ1/孔，然后在酶标板上加盖或者覆膜，在37℃条件下放置化后弃去液体，用洗涂液洗涂，甩干；

2)加生物素标记的肿瘤蛋白p185-1：

每个检测孔中加入100μ1生物素标记的肿瘤蛋白p185-1多肽，在37℃条件下放置比后弃去液体，每个检测孔中加入350μ1洗涂液浸泡2min，甩干或轻轻地拍干，洗涂、甩干的动作重复3次；

3)加辣根过氧化物酶-链亲和素：

每个检测孔中加入100μ1的辣根过氧化物酶-链亲和素，在37℃条件下放置后弃去液体，每个检测孔中加入350μ1洗涂液浸泡2min，甩干或轻轻地拍干，洗涂、甩干的动作重复5次；

4)加显色底物：

在每个检测孔中依次加入显色液a、显色液b各一滴，在37℃条件下避光，显色；

5)加终止液：

按照上述显色底物的加入顺序依次在每个检测孔中加入50μ1终止液，终止反应，终止反应的表现为检测孔中的液体由蓝色快速转变成黄色；

3、结果检测：

在加入终止液后15min内，用酶联仪在450nm的波长条件下检测每个检测孔的光密度0d值，检测试剂盒的检测标准为：待测血清的0d值是p185阴性血清的0d值的2.1倍以上时，检测样判为阳性，否则检测样判为阴性。经检测，本发明制备的包被96孔酶标板的变异系数cv值小于5％，对同一批次及不同批次的检测试剂盒进行试验测试，测试结果显示批内及批间的试剂盒的cv值均小于11％，说明本发明的肿瘤蛋白p185检测试剂盒具有高精密性。

实施例4样本检测

对115例乳腺癌(样本来自苏州大学第一附属医院和苏州大学第二附属医院)、及115例正常献血人员的肿瘤蛋白p185进行检测，同时，将阳性肿瘤患者的肿瘤组织进行石蜡包埋，免疫组化，然后对阳性肿瘤患者免疫组化的肿瘤组织中的肿瘤蛋白p185进行检测，结果如表1所示：

表1患者和正常对照组的肿瘤蛋白p185水平检测数据表

经t检验，乳腺癌患者组的血清中的肿瘤蛋白p185水平均与正常对照组(即献血员组)的血清中的肿瘤蛋白p185水平有显著差异(p<0.05)；

经x2检验，乳腺癌患者组的血清中肿瘤蛋白p185水平与其肿瘤组织中肿瘤蛋白pl85水平高度相关(p<0.01)。在有较多淋巴结或血道转移的乳腺癌，其血清中p185量上升趋势，临床试验结果表明p185-1对于乳腺癌检测具有剂量依赖性，可作为乳腺癌诊断，分化程度的检测。

通过检测发现，本发明试剂盒可以用于癌症的初步检测，具有很高的检测精准度，提高了检测的效率。

实施例5、p185-1在体内抑制肿瘤生长的能力

实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：

用pbs分别溶解曲妥珠单抗、p185-1多肽，分别得到终浓度为2mg/ml的曲妥珠单抗溶液、浓度为0.1mg/ml的p185-1溶液。

取80只5-6周龄balb/c雌性裸鼠(郑州大学实验动物中心)，每只于乳房垫部位皮下接种5x10⁶个p高表达的bt-474乳腺癌细胞，同时包埋0.8mg雌激素缓释片(购买自常州启航生物科技有限公司)。每周两次测量肿瘤长径和短径，根据公式tv＝l/2xaxb2计算肿瘤体积。待肿瘤平均体积长至约100mm³时，将荷瘤balb/c雌性裸鼠随机分为4组，每组20只，而后对每组的每只荷瘤balb/c雌性裸鼠注射不同的药物溶液共计3种类或pbs进行治疗，将第一次注射不同的抗体溶液或pbs记为处理第0天，分别在处理第0天、处理第4天、处理第7天、处理第11天、处理第14天、处理第18天、处理第21天、处理第25天注射，每次对每只荷瘤裸鼠都注射与第一次相同的药物溶液或pbs，每次注射的体积均为100μl，在每次注射前和处理第28天分别测量荷瘤balb/c雌性裸鼠的体重和肿瘤的大小。每次注射的具体方法如下：在第一组的每只balb/c雌性裸鼠的静脉中注射100μl上述p185-1溶液，在第二组的每只balb/c雌性裸鼠的静脉中注射100μl上述曲妥珠单抗溶液，在第三组的每只balb/c雌性裸鼠的静脉中注射100μlpbs。不同药物对balb/c雌性裸鼠的bt-474乳腺癌的治疗情况见图1-2所示，具体数值见下表：(肿瘤大小单位：mm³)

表2

实验结果显示，在用多肽或曲妥珠单抗溶液或pbs对荷bt-474乳腺癌肿瘤细胞的balb/c雌性裸鼠处理第28天，注射pbs的balb/c雌性裸鼠的肿瘤平均大小为551.2mm³±120.3mm³；注射p185-1多肽溶液的balb/c雌性裸鼠的肿瘤大小为20.6mm³±7.2mm³，注射曲妥珠单抗溶液的balb/c雌性裸鼠的肿瘤大小为70.2mm³±6.5mm³。

实验表明，与pbs和单抗相比，本发明的多肽对bt-474乳腺癌有明显的抑制作用，大部分肿瘤停止生长或完全消失(p值〈0.05)。比单抗的治疗效果还好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>苏州立豪生物科技有限公司

<120>一种用于检测乳腺癌的试剂盒

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>108

<212>prt

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

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