一种犬降钙素原检测试剂盒和该检测试剂盒中荧光试剂的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种犬降钙素原快速定量检测试剂盒。

背景技术：

犬降钙素原(canineprocalcitonin，cpct)是无激素活性的降钙素前体物质，是犬的一种主要的急性期反应蛋白（acurephaseprotein,app）。来自定位于第11号染色体上(llp15，4)的单拷贝基因，由116个氨基酸组成，分子量为13kd的糖蛋白。pct由n末端-降钙素-c末端三部分组成，其不会降解为降钙素，不受体内激素水平影响。pct由神经内细胞（包括甲状腺、肺和胰腺组织细胞）在受到促炎症反应刺激特别是受到细菌引起的刺激后表达，半衰期为25～30小时，是用于检测细菌感染所致炎症反应的较好指标之一。

cpct是一种能特异性区分细菌感染和其它原因导致的炎症反应的重要标志物，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，其在血浆中的水平升高。在导致全身炎症反应综合征(sirs)的许多情况下，诸如细菌性感染、胰腺炎、烧死、多发伤，血中pct的含量异常升高，而ct无明显变化。血中pct水平与感染及损伤的严重程度呈正相关，且己成为用于脓毒症、严重脓毒症、脓毒休克的诊断和疗效监测的有效指标。临床资料显示，cpct浓度>0.ing/ml时说明存在临床相关的细菌感染，需要采用抗生素进行治疗；当cpct浓度>0.5ng/ml时，要考虑患者可能有发展成重症败血症或败血症性休克的危险。cpct反映了全身炎症反应的活跃程度，可以作为一个全身性细菌感染和脓毒症辅助和鉴别诊断的实验室常规指标。影响cpct水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。检测病例中cpct浓度的变化，有利于判断机体细菌感染情况，评判机体健康状况，对临床和基础性研究都有重要意义。

自上世纪80年代以后，免疫学检测技术随着单克隆抗体、人工多肽、基因工程及各种标记技术的成熟而迅速发展，免疫比浊法、速率散射比浊法(ina)、胶乳增强透射比浊法(ita)与化学发光分析技术逐渐取代传统的免疫沉淀、免疫凝集物，使检测更为快捷，近些年快速检测(poct)的应用使免疫学操作更为简单、方便。

cpct的检测方法除了过去使用费时不易自动化的凝胶层分析法和高效液相色谱分析法外，常用的免疫学检测方法有：放射性免疫分析法(ria)、酶联免疫吸附试验(elisa)、胶体金免疫层析法(gica)和化学发光免疫分析法(clia)等。ria有很高的检测灵敏度，但由于标记物具有放射性危害，标记物稳定性差，废弃物难以处理等缺点，已逐渐退出临床检验领域；elisa是利用两种双抗体夹心法原理检测血清中cpct，方法较特异，无交叉反应，但是检测敏感性低，最低限为仅l0ug/l，正常血清中pct浓度不能检出，且线性范围窄、不易实现全自动化等缺陷；gica具有操作简单，检测速度快等优点，但也存在灵敏度低、试剂不稳定、重复性较差、难以进行定量等缺点；clia法是在riah和elisa基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势，但现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒多为进口的封闭式全自动化学发光检测系统，需要昂贵的全自动化学发光检测仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。

近几年，随着poct技术的发展，荧光免疫层析技术有了长足的发展，该技术克服了gica的不足并保留了快速、简便的优势，其高灵敏、高特异的优势使其在现地有了很好的应用。本发明研究表明，常规的荧光免疫产品形式类似于金标产品，荧光抗体干燥包被于结合垫上，通过样品稀释液复溶后反应。由于荧光材料、生物原料、结合垫材质及生产工艺的差异影响了产品的重复性和稳定性，成为本技术发展的瓶颈。

技术实现要素：

本发明提供一种犬降钙素原快速定量检测试剂盒，可用于末梢血或静脉血中cpct快速定量分析，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的优点。

为解决上述技术问题，本发明的犬降钙素原检测试剂盒为顶部敞口的盒体，其结构特点是所述盒体的敞口上扣装有扣罩，扣罩内安装试纸板且扣罩倾斜设置，扣罩的低端通过弹片连接在盒体上、扣罩的高端设置反应键，扣罩上在靠近反应键的位置上开设加样孔；所述试纸板包括pvc底衬板、硝酸纤维素膜、吸水垫和样品处理垫，硝酸纤维素膜、吸水垫和样品处理垫均粘贴在pvc底衬板上且硝酸纤维素膜位于中部、样品处理垫和吸水垫分别搭接在硝酸纤维素膜的高端和低端，硝酸纤维素膜的中部平行设有一条包被有抗犬降钙素原多抗的检测线和一条包被有羊抗鼠igg二抗的质控线，扣罩上开设有正对硝酸纤维素膜中部的观察窗；盒体的内部设置有试剂槽，试剂槽位于pvc底衬板贴有样品处理垫一端的正下方，试剂槽内盛装有荧光试剂，试剂槽的开口上封装有密封薄膜，pvc底衬板的底面上连接有可在反应键按下时将密封薄膜刺破的钩刺。

所述样品处理垫包括经处理液处理后的全血滤膜和经红细胞单抗处理后的玻璃纤维膜，玻璃纤维膜设置于外层，全血滤膜设置于内层，玻璃纤维膜和全血滤膜于室温相对湿度不高于30%的条件下密封干燥处理。

所述处理液为含有0.2-1%%tween-20、0.1-2%bsa和0.5-1%阻断剂的0.02m、ph7.0-8.0的tri-cl缓冲液，所述红细胞单抗处理液为含有0.2-1%%tween-20、0.1-2%bsa和0.5-3mg/ml抗-hb单抗的0.02m、ph7.0-8.0的tri-cl缓冲液。

所述检测线l-t和质控线l-c由喷膜仪以1-2ul/cm喷速、0.7cm间距在硝酸纤维素膜上平行划线形成，喷膜仪用到的两种抗体溶液分别为将抗犬降钙素原多抗用0.02m、ph7.0的tri-cl缓冲液配制成1-2mg/ml的抗体溶液和将羊抗鼠igg二抗用0.02m、ph7.0的tri-cl缓冲液配制成1-2mg/ml的抗体溶液，喷线后的硝酸纤维素膜于室温相对湿度不高于30%的条件下干燥、密封保存。

一种荧光试剂的制备方法，其特征是包括如下步骤：

步骤1）取荧光微球经4000rpm离心30min，收集沉淀，用0.01m、ph5.0的硼酸盐缓冲液调整微球浓度为od450=0.2，分别加入10mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺200ul和30mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺80ul，震荡混匀，室温活化45min，得到初级产品；

步骤2）将初级产品经4000rpm离心30min，沉淀用0.05m、ph9.5的cbs溶液重悬，调整微球浓度为od450nm为0.2，同时将犬降钙素原单克隆抗体用ph9.5的0.025m碳酸盐缓冲液透析过夜，按600-800ug/mg比例向荧光微球重悬液中加入犬降钙素原单克隆抗体，4℃搅拌过夜，加入nabh3cn至终浓度5mm，反应1.5h得到中级产品；

步骤3）在中级产品中加入等体积封闭液37℃封闭1h，用0.1m、ph7.8的tri-cl缓冲液洗涤3次，每次20min，最后用100ul样品缓冲液重悬即得荧光微球标记的犬降钙素原单克隆抗体荧光试剂，4℃保存备用。

所述封闭液包括2-5%bsa的0.1m、ph70-8.0的tri-cl缓冲液，所述样品缓冲液包括1-2%bsa、0.1-0.5%peg2000、2-5%海藻糖的0.02m、ph7.0-8.0的tri-cl缓冲液。

本发明试剂盒的使用过程为：将一定量的待检测样品（如血清10ul或全血20ul等）滴加于加样孔中，样品被样品处理垫吸附处理，按下反应键，钩刺刺穿试剂槽的密封薄膜，样品处理垫浸入试剂槽内，样品中的目标抗原与试剂池中的荧光试剂发生特异性反应，生成含荧光标志物的抗原抗体复合物，在毛细作用下该复合物在硝酸纤维素膜上向前层析，并与检测线、质控线处抗体发生反应，根据反应区荧光信号值计算样品中犬降钙素原的含量。

本发明的有益效果是：将待检样本于反应前经样品处理垫特殊预处理，可用于血清、血浆、末梢血、静脉血等中cpct快速定量分析，具有快速、简便、抗干扰能力强等优势；独特的荧光抗体试剂独立设计，克服了传统的干燥包被导致的试剂性能不稳定，准确性、重复性差等缺点，极大提高了产品的稳定性，检测结果更加准确可靠，具有更好的重复性、线性，为细菌性感染的诊断、鉴别诊断、治疗疗效监测及愈后评估提供支持，具有良好的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

图1为本发明试剂盒的结构示意图；

图2为本发明中试纸板的结构示意图。

具体实施方式

参照附图，本发明的犬降钙素原检测试剂盒包括顶部敞口的盒体1，盒体的敞口上扣装有扣罩2，扣罩2内安装试纸板3且扣罩2倾斜设置，扣罩2的低端通过弹片4连接在盒体1上、扣罩2的高端设置反应键5，扣罩2上在靠近反应键5的位置上开设加样孔6；所述试纸板3包括pvc底衬板7、硝酸纤维素膜8、吸水垫9和样品处理垫14，硝酸纤维素膜8、吸水垫9和样品处理垫14均粘贴在pvc底衬板7上且硝酸纤维素膜8位于中部、样品处理垫14和吸水垫9分别搭接在硝酸纤维素膜8的高端和低端，硝酸纤维素膜8的中部平行设有一条包被有抗犬降钙素原多抗的检测线l-t和一条包被有羊抗鼠igg二抗的质控线l-c，扣罩2上开设有正对硝酸纤维素膜8中部的观察窗13；盒体1的内部设置有试剂槽10，试剂槽10位于pvc底衬板7贴有样品处理垫14一端的正下方，试剂槽10内盛装有荧光试剂，试剂槽10的开口上封装有密封薄膜11，pvc底衬板7的底面上连接有可在反应键按下时将密封薄膜11刺破的钩刺12。

样品处理垫10包括经处理液处理后的全血滤膜和经红细胞单抗处理后的玻璃纤维膜，玻璃纤维膜设置于外层，全血滤膜设置于内层，所述玻璃纤维膜和全血滤膜于室温相对湿度不高于30%的条件下密封干燥处理。

处理液为含有0.2-1%%tween-20、0.1-2%bsa和0.5-1%阻断剂的0.02m、ph7.0-8.0的tri-cl缓冲液，所述红细胞单抗处理液为含有0.2-1%%tween-20、0.1-2%bsa和0.5-3mg/ml抗-hb单抗的0.02m、ph7.0-8.0的tri-cl缓冲液。

检测线l-t和质控线l-c由喷膜仪以1-2ul/cm喷速、0.7cm间距在硝酸纤维素膜上平行划线形成，喷膜仪用到的两种抗体溶液分别为将抗犬降钙素原多抗用0.02m、ph7.0的tri-cl缓冲液配制成1-2mg/ml的抗体溶液和将羊抗鼠igg二抗用0.02m、ph7.0的tri-cl缓冲液配制成1-2mg/ml的抗体溶液，喷线后的硝酸纤维素膜于室温相对湿度不高于30%的条件下干燥、密封保存。

本发明的犬降钙素原检测试剂盒中荧光试剂的制备方法包括如下步骤：步骤1）取荧光微球经4000rpm离心30min，收集沉淀，用0.01m、ph5.0的硼酸盐缓冲液调整微球浓度为od450=0.2，分别加入10mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺200ul和30mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺80ul，震荡混匀，室温活化45min，得到初级产品；步骤2）将初级产品经4000rpm离心30min，沉淀用0.05m、ph9.5的cbs溶液重悬，调整微球浓度为od450nm为0.2，同时将犬降钙素原单克隆抗体用ph9.5的0.025m碳酸盐缓冲液透析过夜，按600-800ug/mg比例向荧光微球重悬液中加入犬降钙素原单克隆抗体，4℃搅拌过夜，加入nabh3cn至终浓度5mm，反应1.5h，得到中级产品；步骤3）在中级产品中加入等体积封闭液37℃封闭1h，用0.1m、ph7.8的tri-cl缓冲液洗涤3次，每次20min，最后用100ul样品缓冲液重悬即得荧光微球标记的犬降钙素原单克隆抗体荧光试剂，4℃保存备用。

封闭液包括2-5%bsa的0.1m、ph70-8.0的tri-cl缓冲液，样品缓冲液包括1-2%bsa、0.1-0.5%peg2000、2-5%海藻糖的0.02m、ph7.0-8.0的tri-cl缓冲液。

综上所述，本发明不限于上述具体实施方式。本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可做若干的更改或修饰。上述更改或修饰均落入本本发明的保护范围。