一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途与流程

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途。
背景技术：
：2007年10月，由欧洲心脏病学会(esc)、美国心脏病学会(acc)、美国心脏学会(aha)和世界心脏联盟(whf)全球心肌梗死的统一定义，将急性心肌梗死(ami)定义为由于心肌缺血导致心肌细胞死亡，此定义在新版中没有变化。ami是冠状动脉粥样硬化性心脏病的一种严重病症，发病凶险、死亡率高，治疗的最佳时间为发病后120分钟内，因此，临床快速检测对诊断和控制ami病情颇为关键。现代医学研究表明，可以通过联合检测心肌早期标志物(myo)、确定标志物(ctni)和损伤标志物(ck-mb)，来提高临床对ami诊断的早期性、快速性和正确性。肌酸激酶同工酶(creatinekinase-mb，ck-mb)的检测可用于急性心肌梗死(ami)的诊断和预后，心肌炎诊断和预后，肌肉疾病的诊断，脑疾病如脑梗死、脑膜炎、脑炎等疾病的诊断等。肌酸激酶(creatinekinase，ck)旧称为肌酸磷酸激酶(creatinephosphokinase，cpk)。ck分子量为81000，由两个亚基组成。通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、atp再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与atp之间的转磷酰基反应。ck在atp参与下催化肌酸磷酸化，生成atp和磷酸肌酸。这种酶催化反应是可逆的。1979年首次发现前列腺癌患者血清中肌酸激酶的含量显著升高，此后在其他类型的癌症患者中也有相同的发现。随着研究的深入，近年来人们开始通过筛选肌酸激酶抑制剂寻找新的抗肿瘤药物。正是由于肌酸激酶具有的重要的生理功能，更加引起了人们的广泛的注意和深入的研究。肌酸激酶同工酶(ck-mb)二聚体的每个亚基的n末端均有一个小结构域通过连接序列连接到c-末端的一个大结构域上。整个二聚体中，98％的酪氨酸残基被包裹在空间结构内部，仅有2％暴露在结构表面；另外，每个亚基表面均包含2个可以反应的组氨酸残基和2个可以反应的巯基。其复杂的空间结构给体外重组技术的应用带来了很大困难。因此重组难度高，目前市面上高品质的ck-mb均为血源型。但因来源受限价格昂贵，严重阻碍ck-mb诊断产品的研究开发。虽然国内外关于ck-mb相关的报道很多，但多数研究属于学术性研究，主要关注该蛋白酶的结构、功能；而真正关于其产品应用的研究很少。2001年，yoshikosunahara等同时表达mb、mm、bb三种同工酶，分别纯化后按50:40:10的比例混合处理，运用蛋白动力学原理，完成mb的后期折叠，得到了ck活性较高的蛋白。但该研究就此结束，没有对该蛋白的稳定性、特异性、灵敏度及作为生物原材料的应用做任何研究。另外该研究中，mb的表达及混合比例复杂，工艺稳定性难以控制，不可能用于产品化生产。huangy等(2006)选择体外表达其同工酶mm，但mm或者bb同工酶的空间结构和mb迥然不同，与mb的天然结构更是相差甚远，不可能代替ck-mb作为临床检测的校准质控品。肌酸激酶同工酶由于是一种生物大分子蛋白质，并且以二聚体的形态存在的，因此，极其不稳定，其苛刻的储存，运输，使用条件等给蛋白的使用带来诸多不便。市场上大多数公司试剂盒的校准品均是以冻干品的形式保存的，低温冻干是目前用于蛋白质，微生物等生物制品干燥保存的一种最有效，最常用的方法。目前，常用的重组蛋白冻干保护剂包括糖类及聚合物，多元醇，无表面活性剂，水溶性氨基酸以及某些盐和胺等，但是稳定性都不足够好。目前，肌酸激酶同工酶的免疫检测方法有多种，其中包括放射性同位素免疫分析法(ria)、酶联免疫吸附法(elisa)、胶体金免疫层析法(ica)以及近年来逐渐被广泛适用的化学发光法(clia)等。放射性同位素免疫分析法(ria)的检测原理，将同位素标记的抗原与待测的未标记的抗原分别与不足量的特异性抗体竞争性的结合反应后，通过测量反应的放射性，获得待测抗原的量。该法是80年代以来被日益广泛应用的超微量分析技术。酶联免疫吸附法(elisa)检测原理，以双抗体夹心法为例，是在固相载体上包被一种特异性抗体，加入待测样本后，再加入酶标记的另一种抗体，形成双抗体夹心复合物，再通过发光底物的显色作用，使仪器可以定量检测出的免疫反应。胶体金免疫层析法作为poct检验的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。其原理如下，仍以双抗体夹心法为例，当含有抗原的样本滴加到吸收孔后，抗原先与胶体金标记的抗体结合形成抗原-抗体复合物，然后固定在样品垫上的另一种抗原会捕获该复合物，形成双抗体夹心复合物，并产生一个色带，而被检测到的免疫检测法。化学发光法作为近年来逐渐兴起的一种免疫检测技术，是将免疫反应系统和化学发光技术紧密结合的产物。其中化学发光技术是利用发光物质，如吖啶酯等，经氧化剂氧化和催化剂催化后，形成一个激发态的中间体，再利用相应的测量仪器测量该中间体在回到基态时产生的光量子产额的检测手段。而免疫反应系统是将发光标记物质标记在抗原或抗体上，再通过形成抗原-抗体复合物进行检测。该技术具有特异性强、灵敏度高、精密度好、线性范围宽、高通量和易于实现自动化的优点。直接化学发光免疫分析是指用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，在氧化剂(h2o2)和naoh的作用下，吖啶酯便可分解、发光，无需催化剂。强烈的直接发光在一秒内完成，为快速的闪烁发光，发光强度同待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。目前，市面上虽然存在检测肌酸激酶同工酶的化学发光法试剂盒，但是，其中很多试剂盒存在着灵敏度不足、特异性不高等缺点。与此同时，校准品在稳定性不够好，在液体环境中不稳定，容易水解，不利于长期保存。例如，cn102435738a、cn107389941a、cn109490549a、cn109613242a均公开了一种通过化学发光方法对肌酸激酶同工酶进行检测的试剂盒。但是，前述文献中公开的肌酸激酶同工酶试剂盒的校准品的稳定性都不足够好。放射性同位素免疫分析法(ria)具有操作繁琐、耗时长、结果重复性差、灵敏度和特异性差等问题，且存在放射污染的危险，不适用于大批量检测，现已基本不使用。酶联免疫吸附法(elisa)，则存在着操作繁琐、灵敏度低、线性范围窄和检测周期长等缺点。而早期ami发作时，其血清中肌酸激酶同工酶的含量往往很低，由于灵敏度低和检测周期长，该法无法快速准确的检测出早期ami，这也进一步限制了elisa在心肌检测中的使用。胶体金免疫层析法作为poct检验的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。但由于该法的灵敏度差，进一步限制了其在肌酸激酶同工酶临床检测上的应用。酶促化学发光法是辣根过氧化物酶系统和碱性磷酸酶系统。具有激发发光时间长，测试速度慢，酶易受环境温度的影响等缺点，试剂的稳定性不如直接化学发光好。电化学发光法是三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物在三丙胺的作用下发生氧化还原反应后发出可见光。激发过程复杂，时间长，每一个发光速度约为25秒。液体的ck-mb校准品储存时间相对较短，限制了ck-mb试剂盒的有效期。冻干的ck-mb校准品的复溶稳定性不够好，影响性能。因此，需要提供一种稳定的ck-mb校准品稀释液，使得ck-mb在低温下干燥，能很快地吸水还原成干燥前的鲜活状态。与此同时，需要克服现有技术的不足之处，以解决肌酸激酶同工酶校准品储存时间短、运输不便；冻干品复溶性差的问题。技术实现要素：发明要解决的问题本发明的目的在于，提供一种肌酸激酶同工酶样品稀释液，和含有前述稀释液的肌酸激酶同工酶检测试剂盒。本发明的另一目的在于，提供一种前述肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法。本发明的另一目的在于，提供一种前述酸激酶同工酶样品稀释液和含有前述稀释液的肌酸激酶同工酶检测试剂盒的用途。用于解决问题的方案具体来说，本发明记载了如下技术方案。【1】、一种肌酸激酶同工酶样品稀释液，其中，所述稀释液包括：ph7.2-8.5的缓冲液、离子螯合剂和保护剂，其中，所述保护剂包含选自由牛血清白蛋白、casein、复合酶保护剂afp和复合酶保护剂hpd所组成的组中的一种或多种。【2】根据【1】所述的稀释液，其中，所述缓冲液为mopso缓冲液；优选的，所述mopso缓冲液的ph值为7.2。【3】根据【1】-【2】任一项所述的稀释液，其中，所述保护剂选自牛血清白蛋白、复合酶保护剂afp和复合酶保护剂hpd，所述离子螯合剂为edta；其中，所述牛血清白蛋白的含量为1％-10％，优选为2-5％，更优选为3％；所述复合酶保护剂afp的含量为3-10％，优选为5％；所述复合酶保护剂hpd的含量为3-10％，优选为5％；所述edta的浓度为5-15mm，优选为10mm。【4】根据【1】-【3】任一项所述的稀释液，其中，所述样品为校准品；优选的，所述校准品为冻干校准品。【5】一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括：包被于磁性微球的第一抗体、标记有示踪标记物的第二抗体和如【1】-【4】任一项所述的肌酸激酶同工酶样品稀释液；其中，所述第一抗体和所述第二抗体所识别的肌酸激酶同工酶的特异性结合位点不同；任选的，所述检测试剂盒还包含校准品。【6】根据【5】所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其中，所述第一抗体为ckmb-bb，所述第二抗体为ckmb-04；优选的，所述磁性微球和第一抗体的质量比为100:0.5-1.25，所述示踪标记物和第二抗体的质量比为15-40:1。【7】根据【5】-【6】任一项所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其中，所述示踪标记物选自由鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯和金刚烷所组成的组中的一种或多种；优选的，所述示踪标记物为吖啶酯。【8】根据【5】-【7】任一项所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：磁性微球清洗液、底物液a和底物液b；其中，所述磁性微球清洗液含有pbst缓冲液，所述底物液a为h2o2和hno3的混合液，所述底物液b为tritonx-100和naoh的混合液；优选的，所述h2o2的质量分数为0.01-5.0％，所述hno3的浓度为0.01-1.0mol/l，所述tritonx-100的质量分数为0.01-2.0％，所述naoh的浓度为0.05-1mol/l。【9】根据【5】-【8】任一项所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：磁性微球包被步骤：将所述第一抗体包被于所述磁性微球上；示踪标记物标记步骤：将所述示踪标记物标记于所述第二抗体上；制备样品稀释液步骤：将所述样品稀释液中的各组分混合。【10】根据【9】所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法，其中，所述磁性微球包被步骤中使用2-(n-吗啉代)乙磺酸作为缓冲液；任选的，所述磁性微球包被步骤中还使用封闭液，所述封闭液为bsa；和/或所述示踪标记物标记步骤中使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸作为缓冲液。【11】根据【1】-【4】任一项所述的肌酸激酶同工酶样品稀释液或根据【5】-【8】任一项所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒在制备用于诊断心肌梗死的试剂中的应用。发明的效果在一个实施方式中，本发明中采用了多种类型的保护剂的组合用于制备用于检测肌酸激酶同工酶的样品，例如冻干校准品，最终使得肌酸激酶同工酶的冻干校准品的复溶稳定性长，保护期长，储存，运输稳定。在另一个实施方式中，本发明提供一种肌酸激酶同工酶的检测试剂盒，该试剂盒具有更优的灵敏度和特异性，能够在不加入其它催化剂的前提下快速检测，例如通过直接化学发光法，快速检测低浓度的肌酸激酶同工酶，可用于心肌梗死的早期诊断。在另一个实施方式中，本发明提供的检测试剂盒在节约成本的同时，降低了抗体对于肌酸激酶同工酶的非特异性结合，提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合。附图说明图1示出了各缓冲体系下校准品的稳定性比较(其中纵坐标表示浓度点相对光单位p的降幅，横坐标表示测量时间点第3天、第5天和第7天)；图2示出了不同保护剂对校准品稳定性的影响(其中纵坐标表示浓度点相对光单位p的降幅，横坐标表示测量时间点第3天、第5天和第7天)；图3示出了不同浓度的edta对校准品稳定性的影响(其中纵坐标表示浓度点相对光单位p的降幅，横坐标表示测量时间点第3天、第5天和第7天)；图4示出了不同浓度的牛血清白蛋白(bsa)对校准品稳定性的影响(其中纵坐标表示浓度点相对光单位p的降幅，横坐标表示测量时间点第3天、第5天和第7天)；图5示出了不同浓度的复合酶保护剂afp对校准品稳定性的影响(其中纵坐标表示浓度点相对光单位p的降幅，横坐标表示测量时间点第3天、第5天和第7天)；图6示出了不同浓度的复合酶保护剂hpd对校准品稳定性的影响(其中纵坐标表示浓度点相对光单位p的降幅，横坐标表示测量时间点第3天、第5天和第7天)；图7示出了校准品复溶稳定性(其中纵坐标表示总降幅，横坐标表示测量时间点第3天、第7天、第15天、第23天和第30天；图7表明本发明的校准品稀释液做成冻干品后，复溶稳定性在2-8℃复溶保存30天下降比例在8％左右，稳定性较好)；图8示出了采用本发明稀释液配制的校准品制作的标准曲线(本发明稀释液配制冻干后复溶的校准品制作的标准曲线(logx-logy)，相关性r2值可达0.9975。图8表明本发明的校准品在0-300ng/ml之间线性良好)；图9示出了临床样本测定结果，表明本发明的试剂线性相关性r2值可达0.9973；图10示出了临床样本测定结果(其中纵坐标是本发明实施例4所述检测方法测定结果，横坐标是贝克曼ck-mb试剂盒测定结果，相关性r2值可达0.9963)。具体实施方式本申请的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所做出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。需要说明的是：本说明书中，术语“磁性微球”与“磁珠”具有相同的含义，是指具有细小粒径的超顺磁微球，一般具有超强的顺磁性。其表面可包被上特异性抗体、受体等，用于分离纯化样品中的靶体。磁珠已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。<第一方面>本发明提供了一种肌酸激酶同工酶样品稀释液，其中，所述稀释液包括：ph7.2-8.5的缓冲液、离子螯合剂和保护剂，其中，所述保护剂包含选自由牛血清白蛋白、casein、复合酶保护剂afp和复合酶保护剂hpd所组成的组中的一种或多种。进一步的，本发明还提供了一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括：包被于磁性微球的第一抗体、标记有示踪标记物的第二抗体和前述肌酸激酶同工酶样品稀释液；任选的，所述检测试剂盒还包含校准品。与此同时，上述第一抗体和第二抗体所识别的ck-mb特异性结合位点是不同的。作为本发明可选的实施方案，本发明中的第一抗体和第二抗体均为抗ck-mb的单克隆抗体。作为本发明优选的实施方案，本发明中的第一抗体为ckmb-bb，第二抗体为ckmb-04。本发明检测ck-mb的方法是双抗体夹心法，该法主要是使用两株不同的特异性单克隆抗体，其中被标记于示踪标记物的抗体的结合位点与包被于磁性微球上的抗体结合位点不同。选择这些结合位点不仅有利于示踪物的标记或磁性微球的包被，也不会阻碍抗体与抗原结合形成夹心复合物，因此，提高了反应的特异性和灵敏度。本发明对于适用于本发明的示踪标记物的种类不作特定限定。举例而言，所述示踪标记物可以是鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯和金刚烷等。作为优选，所述示踪标记物为吖啶酯。本发明对于适用于本发明的磁性微球的种类不作特定限定，可以是本领域常用的磁珠。作为本发明实施方式之一，本发明所使用的磁珠为纳米级fe2o3和fe3o4的磁性微粒与高分子材料进行复合后形成的具有顺磁性和极大蛋白吸附量的微米级固相微球，该磁性微球可以在外加磁场的作用下迅速磁化，在磁场消失后剩磁为零。在本发明中对与其复合所用的高分子材料的种类没有特定限定。本发明所使用的磁珠粒径应在1-5μm，作为本发明实施方案之一，上述磁珠可以通过表面改性而添加多个活性基团，本发明中的活性基团的种类包括但不限于-oh和-cooh。在本发明中，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:0.5-1.25；所述示踪标记物与第二株抗体的质量比不低于15:1；优选的，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:1；所述示踪标记物与第二株抗体的质量比为15-40:1。在本发明中，上述稀释液中edta是一种优良的金属离子络合剂，洗涤剂，血液抗凝剂。生化研究中常用作钙离子螯合剂，用于消除钙或者其它微量重金属导致的酶催化反应中的抑制作用。加入终浓度5-15mm的edta后，可以避免其他微量重金属离子对酶反应的抑制作用，从而增加了蛋白的稳定性。在本发明的一些具体的实施方案中，edta的浓度为10mm时，ck-mb校准品的稳定性最高。牛血清白蛋白(bsa)具有低温保护剂和脱水保护剂的作用，能够对ck-mb抗原起到很好的保护作用。在本发明的一些具体的实施方案中，添加牛血清白蛋白优选终浓度为1％-10％，进一步优选2％-5％，稳定性会明显提高。在本发明的另一些实施方案中，牛血清白蛋白在稀释液中的浓度为3％时，能够最大程度地提高ck-mb冻干校准品的稳定性。复合酶保护剂对血液中蛋白质、酶和脂类等物质均有保护和稳定作用，一方面保持了酶与蛋白质结构生理活性所需要的环境；另一方面，可以为酶和蛋白提高效能，避免冻干过程及复溶后的活性损失，更利于长期保存。加入终浓度5％的复合酶保护剂afp，5％的复合酶保护剂hpd时，ck-mb冻干校准品的稳定性最高。采用上述稀释液配制的ck-mb冻干校准品制作标准曲线，相关系数r2＝0.99以上，校准品在0-300ng/ml之间线性良好。在本发明中，所述肌酸激酶同工酶样品稀释液中的缓冲体系为mopso缓冲体系；优选的，所述mopso缓冲体系的ph值为7.2。在本发明中，所述试剂盒还包括：磁性微球清洗液、底物液a和底物液b。本发明中的磁性微球清洗液为pbst缓冲液；优选的，所述磁性微球清洗液中还包括防腐剂。本发明所适用的防腐剂可以是本领域常用的防腐剂，例如山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、proclin-300(主要活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3酮，是一种较安全的防腐剂，为免疫诊断中叫常用的防腐剂之一)和抗生素中的一种或多种。本发明中所述底物液a为h2o2和hno3的混合液，优选地，h2o2质量分数为0.01-5.0％，hno3浓度为0.01-1.0mol/l。所述底物液b为tritonx-100和naoh的混合液，优选地，tritonx-100的质量分数为0.01-2.0％，naoh的浓度为0.05-1mol/l。适用于本发明的表面活性剂除了tritonx-100外，还可以是本领域常用的表面活性，如tritonx-405、tween20和tween80的一种或多种。在本发明试剂盒中上述表面活性剂的添加量为0.1-2‰，这样，更有利于磁性微球的分散。<第二方面>本发明还提供了一种根据<第一方面>所述的肌酸激酶同工酶ck-mb检测试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：磁性微球包被步骤：将所述第一抗体包被于所述磁性微球上；示踪标记物标记步骤：将所述示踪标记物标记于所述第二抗体上；制备样品稀释液步骤：将所述样品稀释液中的各组分混合。作为本发明的实施方案之一，在第一抗体包被磁性微球步骤中使用2-(n-吗啉代)乙磺酸(即mes)缓冲液。作为本发明的实施方案之一，第一抗体包被磁性微球步骤中还使用封闭液，所述封闭液为20％bsa。作为本发明的实施方案之一，第二抗体标记示踪标记物步骤中使用的抗体偶联缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸(即hepes)缓冲液。作为本发明的实施方案之一，第二抗体标记示踪标记物的标记时间为0.5-2小时；可选的，所述第二抗体标记示踪标记物的标记时间为1小时。在本发明的一个实施方式中，所述的肌酸激酶同工酶ck-mb冻干校准品是含有一定量ck-mb抗原的mopso缓冲液，其中，添加一定的防腐剂。然后进行冻干。该校准品可以在4℃条件下，稳定保存。<第三方面>本发明还提供了一种根据<第一方面>所述的肌酸激酶同工酶样品稀释液或肌酸激酶同工酶检测试剂盒在制备心肌梗死的诊断试剂中的用途。实施例实施例一制备1：包被ck-mb单抗的磁性微球悬浮液(1)量取10mg磁性微球溶液，加入1ml0.1m的mes缓冲液，涡旋混匀，磁铁吸附5～10min，至磁珠被完全吸附至管壁一侧后，弃上清，重复上述清洗步骤3～5次，加入1ml0.1mmes，涡旋混匀；(2)加入100μgck-mb第一株单克隆抗体(磁珠：抗体的质量比为100:1)涡旋混匀，37℃孵育30min；(3)加入10μl10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐(edc)，涡旋混匀，放入37℃培养箱，孵育1.5h；(4)加入200μl的20％bsa溶液，封闭2h。(5)向封闭后的磁珠混悬液中添加1ml发光恢复液2(5g的牛血清白蛋白+400ml的0.025m的tris-hcl缓冲液溶解+1-2‰的tween-80+100ml新生牛血清)，磁铁吸附，去上清，重复上述清洗步骤3～5次。(6)向上述制备好的磁珠加入1ml的发光恢复液2，2～8℃长期保存。制备2：标记吖啶酯的ck-mb单抗溶液的制备(1)将1mgck-mb第二株单克隆抗体置于透析袋中，使用不少于2l的0.05mhepes缓冲液(ph＝8.0)透析24h，中途换液四次。透析完成后将抗体加入milliporeamiconμltra超滤离心管进行浓缩，使抗体浓度大于5mg/ml。(2)将经过浓缩的ck-mb单克隆抗体置于0.5ml的离心管内，加入100μl的溶于dmf的5mg/ml的nsp-sa-nhs溶液，使nsp-sa-nhs与ck-mb单克隆抗体的摩尔比不小于15:1，混匀后，室温(避光)反应2h，加入100μl浓度为100mg/ml的赖氨酸溶液作为封闭缓冲液，反应30min，终止反应。(3)将标记物置于透析袋中，用不少于2l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.01mol/l，ph＝4.5)透析24h，中间换液四次，分离游离的nsp-sa-nhs。(4)收集透析过后的标记物，加入5％bsa溶液使bsa终浓度为1％，然后等体积加入甘油，-20℃保存。制备3：校准品的制备取ck-mb工作液，使用含10mm的edta，3％牛血清白蛋白，5％复合酶保护剂afp和5％的复合酶保护剂hpd的mopso溶液稀释至4ng/ml和140ng/ml的高低点校准品溶液。使用制备1中的制备得到的包被有第一株抗ck-mb的抗体的磁性微球混悬液，制备2中标记有吖啶酯的第二株ck-mb抗体，制备3高低点校准品分别构成试剂盒的组分。制备4：化学发光底物液的配制化学发光底物液a为h2o2和hno3的混合液，其中h2o2质量分数为0.01-5.0％，hno3浓度为0.01-1.0mol/l。化学发光底物液b为tritonx-100和naoh的混合液，其中tritonx-100的质量分数为0.01-2.0％，naoh的浓度为0.05-1mol/l。制备5：清洗液的配制本发明所述清洗液为ph值7.0-9.0、浓度为0.02mol/l的pbst溶液，其中含质量分数为0.5％的tween-20。实施例二肌酸激酶同工酶检测试剂盒中使用的抗体的配组筛选(1)抗体配组筛选本发明使用的ck-mb抗体共有四种：抗体1：ckmb-10-c40a(fitzgerald，lot：m9910207)、抗体2：ckmb-03(菲鹏，lot：20160426-2)；抗体3：ckmb-04(菲鹏，lot：2071104)、抗体4：ckmb-bb(biospacific，lot：a5481)。将抗体1、3、4分别包被磁性微球，形成抗体1-磁性微球、抗体3-磁性微球、抗体4-磁性微球，同时将抗体2、3标记吖啶酯，形成抗体2-吖啶酯、抗体3-吖啶酯。将以上抗体进行组合配对，检测血清样本，从中筛选最优组合。表1抗体配对组合筛选结果如表1所示，组合4中，抗体4同抗体2组合，无法与血清样本中的肌酸激酶同工酶结合；组合2及组合3中，抗体1、抗体3与抗体3、抗体2的配对，检测肌酸激酶同工酶整体信号值偏低，区分度较低；组合5，抗体4与抗体3的配对，各项指标结果较好。表2血清样本符合率检测结果表3血同源样本符合率检测结果参照表2和表3的结果，抗体4和抗体3的组合样本符合率和同源样本符合率都较好。实施例三磁珠吖啶酯制备工艺优化(1)磁珠包被抗体优化工艺表4磁珠包被抗体偶联缓冲液优化mesmopso硼酸缓冲液s06949431693s1295027872326s21135889679411s3168634172850181064s4619634599228649621s5140656911333301265588符合率0.99960.99770.9987综合比较各组数据，选择mes缓冲液作为磁珠包被偶联缓冲液。表5磁珠抗体使用比例筛选结果磁珠：抗体ng/ml100:0.5100:0.75100:1100:1.25s00792672629821s112011228126152622s247240877899368976s335109681129741148826140178s4140396271469700533583518082s5300838337104919811762161173205符合率0.99980.99970.99980.9996抗体加入量增加，抗原检测信号值也随之增加，并对抗原符合率没有明显影响，当磁珠：抗体达到100:1.25时，整体的发光值没有明显上升，因此，本发明选择100：1作为磁珠：抗体加入比例。表6封闭液筛选样本编号1mgly5％bsa20％bsas0335255507s1149419172677s26721789910596s3105807140221169422s4421702490714620613s592336411433011437048符合率0.99990.99920.9994三种封闭液对抗原稀释液检测符合率没有明显影响，20％bsa的发光值更高一点，且检测低值区分度略高，所以，选择20％bsa为封闭液。(2)吖啶酯标记抗体优化工艺表7吖啶酯标记抗体偶联缓冲液优化cbhepestapss0812504355s1271142352375s2101551152210072s3145591172682153894s4570396618728554005s5118314614032621342447符合率0.99980.99960.9986三种偶联缓冲液对抗原稀释液检测符合率无明显影响，hepes样本检测信号值整体较高，且低值区分范围较大，本发明选择hepes作为吖啶酯标记抗体偶联缓冲液。表8吖啶酯标记抗体偶联时间优化0.5h1h2hs0540402376s1274927762911s2109971090311624s3165327177902183645s4609391651064645744s5127218014495721447030符合率0.99980.99980.9997抗体与吖啶酯偶联1h，反应达到平台期。表9吖啶酯抗体使用比例筛选吖啶酯：抗体40:130:120:115:1s0565792759537s1118198420152759s232504415856910449s34652973314132378151619s4160012281253473106564721s534651063332910332441174164符合率0.99980.99980.99990.9998根据上表实验数据，吖啶酯：抗体应不得低于15：1。实施例四ck-mb校准品稀释液的ph值选择1、不同缓冲体系的ck-mb校准品稀释液的配制(1)100mlck-mb校准品缓冲液(0.05mmopso)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(2)100mlck-mb校准品缓冲液(0.05mhepes)称取hepes1.19156g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.5，定容至100ml。(3)100mlck-mb校准品缓冲液(0.05mtris-hcl)称取tris-hcl(国药，20170216)0.60566g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值8.5，定容至100ml。2、ck-mb校准品的冻干实验采用棕色玻璃瓶将校准品按照每瓶500μl进行分装，快速冷冻，置于冷冻干燥机内24-30h冻干，封口保存。3、ck-mb校准品的稳定性实验用步骤1配制的三种稀释液分别制备300ng/ml的冻干校准品，分别于37℃恒温培养箱中放置3天、5天和7天，以2-8℃条件做对照，进行下列实验：(1)将包被磁性微球的ck-mb抗体溶液作为试剂1和标记有吖啶酯的ck-mb抗体溶液作为试剂2置于室温充分混匀30min；(2)将20μl的制备好的抗原溶液加入反应杯中；(3)反应杯中依次加入50μl的试剂1(磁珠混悬液)和50μl的试剂2(吖啶酯溶液)；(4)反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6min；(5)置于磁性条件下，使用磁珠清洗液进行多次清洗；(6)向反应杯中加入100μl的底物液a和底物液b，并检测发光值，发光强度以相对光单位(rlu)表示。4、ck-mb校准品在不同ph值条件下的稳定性分析本实验配制了不同缓冲体系，由此对ph7.2～8.5条件下ck-mb项目的稳定性进行研究。用ph7.2的mopso弱碱体系、ph7.5的hepes弱碱体系、ph8.5的tris-hcl碱性体系这三种缓冲液配制校准品，分别放在37℃恒温培养箱中，进行稳定性实验。如表1-3，p点为300ng/ml校准品，o点为校准品缓冲液。验证在不同缓冲体系之下p点相对光单位(rlu)变化，变化越小表明校准品越稳定。结果表明，在ph7.2的mopos弱碱条件下，p点降幅最低，在15％以下，校准品稳定性较高。(见表10-12)表10mopso缓冲液表11hepes缓冲液表12tris-hcl缓冲液实施例五ck-mb校准品稀释液的保护剂选择1、含有不同保护剂的ck-mb校准品稀释液的配制(1)100mlck-mb校准品缓冲液(保护剂为牛血清白蛋白)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(2)100mlck-mb校准品缓冲液(保护剂为casein)称取mopso1.1263g、edta0.292g、casein5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(3)100mlck-mb校准品缓冲液(保护剂为复合酶保护剂afp)称取mopso1.1263g、edta0.292g、复合酶保护剂afp5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(4)100mlck-mb校准品缓冲液(保护剂为复合酶保护剂hpd)称取mopso1.1263g、edta0.292g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。2、ck-mb校准品的冻干实验采用棕色玻璃瓶将校准品按照每瓶500μl进行分装，快速冷冻，置于冷冻干燥机内24-30h冻干，封口保存。3、ck-mb校准品的稳定性实验用步骤1配制的四种稀释液分别制备300ng/ml的ck-mb冻干校准品，分别于37℃恒温培养箱中放置3天、5天和7天，以2-8℃条件做对照，测试方法同实施例1。4、ck-mb校准品在不同保护剂下的稳定性分析本试验在ph7.2的mopso缓冲体系下采用了不同的保护剂，5％牛血清白蛋白(bsa)，5％caesin，5％的复合酶保护剂afp，5％的复合酶保护剂hpd分别配制成校准品稀释液，用这四种校准品稀释液配制校准品，进行稳定性实验。如表13-16，p点为300ng/ml校准品，o点为校准品缓冲液。p点相对光单位(rlu)变化，变化越小表明校准品越稳定。结果表明，添加5％牛血清白蛋白，5％的复合酶保护剂afp和5％的复合酶保护剂hpd的校准品稀释液的p点降幅较低，校准品稳定性较高。(见表13-16)。表135％牛血清白蛋白对校准品稳定性的影响表145％casein对校准品稳定性的影响表155％复合酶保护剂afp对校准品稳定性的影响表165％复合酶保护剂hpd对校准品稳定性的影响实施例六ck-mb校准品稀释液中各成分最适合浓度的筛选1、含不同浓度edta的ck-mb校准品稀释液的配制(1)100mlck-mb校准品缓冲液(未加edta)称取mopso1.1263g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(2)100mlck-mb校准品缓冲液(5mmedta)称取mopso1.1263g、edta0.146g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(3)100mlck-mb校准品缓冲液(10mmedta)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(4)100mlck-mb校准品缓冲液(15mmedta)称取mopso1.1263g、edta0.438g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。2、含不同浓度牛血清白蛋白(bsa)的ck-mb校准品稀释液的配制(1)100mlck-mb校准品缓冲液(未加牛血清白蛋白)称取mopso1.1263g、edta0.292g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(2)100mlck-mb校准品缓冲液(1％牛血清白蛋白)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)1g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(3)100mlck-mb校准品缓冲液(3％牛血清白蛋白)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(4)100mlck-mb校准品缓冲液(5％牛血清白蛋白)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)5g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。3、含不同浓度复合酶保护剂afp的ck-mb校准品稀释液的配制(1)100mlck-mb校准品缓冲液(未加复合酶保护剂afp)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(2)100mlck-mb校准品缓冲液(3％复合酶保护剂afp)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp3g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(3)100mlck-mb校准品缓冲液(5％复合酶保护剂afp)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(4)100mlck-mb校准品缓冲液(10％复合酶保护剂afp)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp10g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。4、含不同浓度复合酶保护剂hpd的ck-mb校准品稀释液的配制(1)100mlck-mb校准品缓冲液(未加复合酶保护剂hpd)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(2)100mlck-mb校准品缓冲液(3％复合酶保护剂hpd)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd3g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(3)100mlck-mb校准品缓冲液(5％复合酶保护剂hpd)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(4)100mlck-mb校准品缓冲液(10％复合酶保护剂hpd)称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd10g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。5、ck-mb校准品的冻干实验采用棕色玻璃瓶将校准品按照每瓶500μl进行分装，快速冷冻，置于冷冻干燥机内24-30h冻干，封口保存。6、ck-mb校准品的稳定性试验用步骤1-4配制的16种稀释液分别制备300ng/ml的ck-mb冻干校准品，分别于37℃恒温培养箱中放置3天、5天和7天，以2-8℃条件做对照，测试方法同实施例1。7、不同浓度的稀释液成分对ck-mb校准品稳定性的影响(1)通过比较不同浓度edta(0mm、5mm、10mm、15mm)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品稀释液中加入10mmedta，校准品的稳定性最好(见表17)。表17edta浓度筛选(2)通过比较不同浓度牛血清白蛋白(0％、1％、3％、5％)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品稀释液中加入3％牛血清白蛋白，校准品的稳定性最好(见表18)。表18牛血清白蛋白(bsa)浓度筛选(3)通过比较不同浓度复合酶保护剂afp(0％、3％、5％、10％)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品稀释液中加入5％复合酶保护剂afp，校准品的稳定性最好(见表19)。表19复合酶保护剂afp浓度筛选(4)通过比较不同浓度复合酶保护剂hpd(0％、3％、5％、10％)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品稀释液中加入5％复合酶保护剂hpd，校准品的稳定性最好(见表20)。表20复合酶保护剂hpd浓度筛选实施例七ck-mb校准品复溶稳定性试验1、测定步骤：(1)按照下列配方配制最佳稀释液：称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。采用棕色玻璃瓶将校准品按照每瓶500μl进行分装，快速冷冻，置于冷冻干燥机内24-30h冻干，封口保存。(2)用上述步骤(1)得到的稀释液配制300ng/ml、140ng/ml、35ng/ml、4ng/ml、1ng/ml的冻干校准品，复溶后，2-8℃保存30天，以2-8℃冻干校准品做对比，测试校准品的复溶稳定性。(3)测定方法：a.将包被磁性微球的ck-mb抗体溶液作为试剂1和标记有吖啶酯的ck-mb抗体溶液作为试剂2置于室温充分混匀30min；b.将20μl复溶好的校准品溶液加入反应杯中；c.反应杯中依次加入50μl的试剂1(磁珠混悬液)和50μl的试剂2(吖啶酯溶液)；d.反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6min；e.置于磁性条件下，使用磁珠清洗液进行多次清洗；f.向反应杯中加入100μl的底物液a和底物液b，并检测发光值，发光强度以相对光单位(rlu)表示。2.测定结果通过试验，测试用本发明的稀释液的冻干校准品的复溶稳定性，结果表明，在复溶30天内，校准品的稳定性较好(见表21)。表21校准品复溶稳定性实施例八空白限的检测其检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的yy/t1233-2014《心肌肌钙蛋白-i定量测定试剂(盒)(化学发光免疫分析法)》的试验方法进行。重复检测空白样本(样本稀释液)20次，再根据检测结果，利用公式计算分析灵敏度，结果见表23。表22初始校准曲线的检测结果rlu浓度s03690s127361s2107954s317810535s4661426140s51449379300表23空白限的检测结果根据零浓度校准品(s0)和相邻的校准品(s1)之间的浓度-化学发光(rlu)值的结果进行两点回归拟合得出一次方程，再将20孔空白样本(s0)检测获得的mean+2sd所对应的rlu值代入上述方程，所获得的浓度值，即为分析灵敏度，本发明的分析灵敏度可达到0.06ng/ml，这对于ami的早期诊断具有极大的意义。实施例九天内精密度的检测重复检测高、低标准品各10次，再根据检测结果，计算cv，结果见表24。表24天内精密度的检测结果测试次数qcl信号qch信号qcl浓度qch浓度136355248470.990285715159.3409027233025085370.897685624154.2831433340474957551.105108612150.3218863437555059081.02370137153.4682135537465111621.021194379155.0969247637585371511.024537062163.1586667738575029761.052123002152.5594695837084778231.010610758144.7683599937525004641.022865692151.7809921038295080451.044319337154.1306276mean1.019243155153.8909186cv5.15％3.21％本发明的精密度可达到5.15％和3.21％，这对于ami的诊断准确性具有极大的意义。实施例十线性相关性的检测复孔检测线性样本，并计算各点的理论值和实测值的线性相关系数，结果见表25。表25线性相关性的检测结果发光值1发光值2实测值(ng/ml)理论值(ng/ml)样本1752782779120340.20340.20样本2546884551542241.35226.86样本3292373305655128.87113.52样本415283016202866.4756.85样本5963189255639.2334.19样本620341198287.946.98样本75794660.180.18线性相关性0.9973本发明的线性相关性r>0.990。复孔检测线性样本(7点)，并计算各点的理论值和实测值的线性相关系数。其中，理论浓度未利用校准曲线计算所得的浓度，而实测值为利用比对机器罗氏检测后的样本值。附图9表明线性相关性良好。实施例十一准确度检测血清添加比例按照1:9稀释后检测采取回收试验检测试剂盒的准确度，检测结果见表26。表26回收试验的检测结果a液浓度b液浓度混合浓度回收率226.0940.68115822.27394228.07790.7660322.39977210.81270.72659121.62178均值221.66150.72459322.0985理论浓度22.8182896.85％回收试验结果可达到90％以上，说明本发明建立的ck-mb检测方法的准确度良好，并且基本没有基质效应。实施例十二ck-mb校准品临床检测应用收集28例临床样本，选用罗氏ck-mb体外诊断试剂盒进行方法学比较。测定步骤：(1)按照下列配方配制最佳稀释液：称取mopso1.1263g、edta0.292g、牛血清白蛋白(bsa)3g、复合酶保护剂afp5g、复合酶保护剂hpd5g。加入60ml纯化水，完全溶解后，调节ph值7.2，定容至100ml。(2)用上述步骤(1)得到的稀释液配制300ng/ml、140ng/ml、35ng/ml、4ng/ml、1ng/ml的校准品，进行冻干，复溶后，作标准曲线；(3)测定方法：a.将包被磁性微球的ck-mb抗体溶液作为试剂1和标记有吖啶酯的ck-mb抗体溶液作为试剂2置于室温充分混匀30min；b.将20μl复溶好的校准品溶液加入反应杯中；c.反应杯中依次加入50μl的试剂1(磁珠混悬液)和50μl的试剂2(吖啶酯溶液)；d.反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6min；e.置于磁性条件下，使用磁珠清洗液进行多次清洗；f.向反应杯中加入100μl的底物液a和底物液b，并检测发光值，发光强度以相对光单位(rlu)表示。1.测定结果采用本发明稀释液配制冻干后复溶的校准品制作的标准曲线(logx-logy)如图8示，相关系数r2＝0.9975，表明校准品在0-300ng/ml之间线性良好。将本发明稀释液配制冻干后复溶的校准品的测定结果与罗氏ck-mb体外诊断试剂盒进行方法学比较，结果如图10示，相关系数r2＝0.9963，表明本发明稀释液配制的校准品的测定结果与罗氏ck-mb试剂盒测定结果高度相关，一致性较高。本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页12