>[0028] 将透析过的抗体和交联剂SMCC按分子摩尔比以1:5的比例混合，SMCC浓度2mg/ L，25°C搅拌反应 1 小时，用 Histrap Desalting G25 在 AKTA purifier 100 上脱盐，洗脱液 为PBS，流速为5ml/min。
[0029] 5.偶联剂活化的抗体与巯基化DNA的交联
[0030] 由于巯基修饰的结构是H0-C6-S-S-C6-P03_oligo。在用之前要用DTT使二巯基断 裂，然后脱盐之后在进行连接。把寡核苷酸溶解在ΙΟΟηΜ pH7. 5体积为900ul的磷酸缓冲 液中，加入lOOulDTT，室温孵育lh。用脱盐的方法去除DTT和从寡核苷酸上脱离的保护基 团。用缓冲液预先平衡NAP-10柱子，加lmL的样品用1. 5mLPBS缓冲液进行洗脱。流速为 5ml /min，立刻用于连接。
[0031] 将上述洗脱产物和巯基化DNA纯化产物等摩尔数混合25°C反应1小时，加入 10 μ L lmol/L β -巯基乙醇终止反应，25°C反应30min后纯化。
[0032] 6.纳米磁珠法纯化偶联产物
[0033] 在PCR产物和抗体的偶联物混合液中加入羧化的磁粒，然后用PEG/NaCl沉淀，使 目的DNA吸附至磁珠，最后磁场分离被吸附的DNA，经乙醇洗涤，用水洗脱。
[0034] 7.免疫PCR技术检测偶联物
[0035] 以溶液0. 05m01/L，pH9. 6的碳酸盐缓冲液对重组蛋白进行10倍稀释，使其浓度为 2ng/L，分别取50uL重组蛋白稀释液于TopYield板，4°C过夜包被16h以上。包被板用溶液 洗涤液：含有1 % Tween-20和0. lmmol/L EDTA的PBS液洗涤5次。然后取200 μ L封闭液： 含有终浓度为lg/L叫鲑鱼精DNA，1 % BSA、0. 2%的甘氨酸的溶液于板孔内，放置37°C封闭 lh。洗板，在各孔中加入50 μ L抗重组蛋白单抗（以溶液D将其稀释为1 μ g/ml工作浓度， 溶液D为含有0. 1 % Tween-20和0. 5 % BSA的PBS溶液，置37°C孵育lh。洗板，加入DNA 偶联的抗体，37°C孵育lh后，先用洗涤液洗板15次，然后用双蒸水洗涤3次。在TOpYield 各板孔中按照PCR扩增体系，添加PCR反应液，对板内结合的报告DNA进行PCR检测。选用 TaKaRa one shot LA PCR TM mix试剂盒进行PCR扩增。50yLPCR体系主要包含：上游引 物（20pmol/L)、下游引物（20pmol/L)、Mg2+(2. 5mmol/L)、dNTP (Mixture，0· 4mmol/L)，Taq 酶 (2. 5U)。PCR扩增条件：94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，30个循环。本试验的PCR反应产物 (218bp)通过2%琼脂糖凝胶（Gelred染色）在90V电压条件下电泳25min，然后通过凝胶 成像系统观察电泳结果。结果如图1所示，从图1中可以看出，包被到固相上的抗原结合的 抗体偶联上了 DNA片段，所以该偶联片段得到了扩增。
[0036] 8.对比实施例
[0037] 现有技术制备DNA抗体偶联物的简略方法如下：
[0038] a制备硫代乙酰化的DNA，将氨基修饰的DNA和SATA反应，首先以lOOmM碳酸氢钠 缓冲液化!19.0)透析，然后加入13.31^/11115厶了厶，和50%二甲基甲酰胺（01^)。在25°(：反 应30min，用100mM磷酸钠缓冲液，pH 6. 5透析，浓缩。
[0039] b制备马来酰亚胺修饰的抗体，采用sulfo-SMCC对抗体进行马来酰亚胺化。含有 25nmol 的抗体被加到含 lOOmM 磷酸钠（pH 7. 0)，1. 2mg/ml sulfo-SMCC，1. 5% DMF 的反应 混合液中，25°C反应半小时，立即过柱纯化收集洗脱峰，得到马来酰亚胺化的抗体。
[0040] c抗体和DNA链反应，纯化的马来酰亚胺修饰的抗体加入到15mL离心管中，同时加 入硫代乙酰化的DNA，加入75 μ L的1M盐酸羟胺起始偶联反应，室温暗处反应2小时后加入 10 μ 1 10mM Ν-乙酰马来酰亚胺终止反应。
[0041] 可见本发明的偶联步骤简单，从现有技术的3步简化成2步，从而偶联效率更高， 步骤更简单，更实用于免疫PCR和长链荧光标记抗体等技术。从附图1上也可以看到，在低 到2ng/L的包被浓度时，PCR也可以检测出条带，可见检测效率之高。而且，采用双功能偶 联剂进行偶联时，由于间隔臂的作用，偶联物更稳定。
[0042] 最后所应说明的是，以上【具体实施方式】仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明 的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖 在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种DNA标记抗体的方法，其特征在于，采用异型双功能交联剂活化的抗体偶联巯 基化DNA。2. 如权利要求1所示的方法，其特征在于：所述巯基化DNA的制备方法是利用巯基化 引物和普通引物不对称PCR扩增得到。3. 如权利要求2所示的方法，其特征在于：所述不对称PCR扩增的巯基化引物和普通 引物的比例为50:1。4. 如权利要求1所示的方法，其特征在于：所述异型双功能交联剂，一端是马来酰亚胺 基团，一端是琥珀酰亚胺基团。5. 如权利要求4所示的方法，其特征在于：所述异型双功能交联剂包括MBS、Sulfo MBS、GMBS、SulfoGMBS、EMCS、SulfoEMCS、SMCC、SulfoSMCC、SMPB和SulfoSMPB。6. 如权利要求1所示的方法，其特征在于：所述采用异型双功能交联剂活化的抗体制 备方法为：将透析过的抗体和异型双功能交联剂按摩尔比以1:5的混合，异型双功能交联 剂浓度2mg/L，25°C搅拌反应1小时。7. 如权利要求1所示的方法，其特征在于：先将巯基化标记DNA的二硫键用还原剂打 断，脱盐后立即和活化的抗体等摩尔数混合，25°C反应1小时，加入10μLlmol/Lβ-巯基 乙醇终止反应，25°C反应30min后纯化。8. 如权利要求7所示的方法，其特征在于：所述的纯化方法为磁珠法，在PCR产物和抗 体的偶联物混合液中加入羧化的磁粒，然后用PEG/NaCl沉淀，使目的DNA吸附至磁珠，最后 磁场分离被吸附的DNA，经乙醇洗涤和用水洗脱完成纯化。
【专利摘要】本发明公开了一种DNA标记抗体的方法，采用异型双功能偶联剂活化抗体上的氨基，通过共价键偶联巯基化DNA，形成DNA和抗体的复合物。通过本发明方法得到的DNA抗体复合物，抗体和DNA分子比例固定，可以用于免疫PCR等相应的实验。
【IPC分类】G01N33/533, G01N33/531
【公开号】CN105372415
【申请号】CN201510791972
【发明人】沈鹤霄, 华权高, 徐春雷
【申请人】武汉金开瑞生物工程有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年11月17日