脱水素基因BcDh2及其启动子在培育耐旱植物中的应用的制作方法

专利名称：脱水素基因BcDh2及其启动子在培育耐旱植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及克隆了一个新的脱水素基因BcDh2和其启动子BcDh2P，并且提供了利用此基因遗传转化获得耐旱耐寒转基因植物的分子方法。该基因为脱水素家族YSK2类型成员。
背景技术：
LEA蛋白是胚胎发生的晚期，或干旱，低温或外源ABA处理之后，产生的一类主要的蛋白质。LEA具有保守的结构域，较高的亲水性，可溶性，广泛存在单子叶和双子叶植物中。它们表达的发育阶段特异性及干旱胁迫期间的积累，指出在保护细胞质结构方面起的作用。依据氨基酸组成的不同，LEA分为五类，group I LEA的特征，它有20个氨基酸组成的基序，如小麦Em蛋白；group II LEA称做脱水素(dehydrin)，是LEA中研究最多的，脱水素结构的基本特征是在羧基末端存在2-11个氨基酸组成的富含Lys的K-区段(K-segment，EKKGIMDKIKEKIPG)，可以形成两性的α-螺旋。在中部含有一连串排列的丝氨酸组成的S-区段(S-segment)，丝氨酸被磷酸化，可以通过结合核定位的信号肽参与核运输。在脱水素的氨基末端，有时会存在1-2个Y-区段(Y-segment，T/VDEYGNP)，它与分子伴侣的部分核苷酸结合位点同源。到目前为止，尽管许多研究证实脱水素与大分子，如与核内的核蛋白复合体和脂膜有联系，但脱水素的确切功能仍不清晰。推测脱水素是一种表面活性剂，在细胞干旱和低温条件下能抑制大分子的聚合，保护细胞的完整性(Close，1996，1997)；groupIII LEA含有一个11个氨基酸组成的基序，形成α-螺旋，可能在分子内或分子间的相互作用间起作用；groupIV LEA具有保守的氨基末端形成α-螺旋，和一个多变的羧基末端，具有无规则卷曲结构；groupV LEA含有比其他group更多的疏水氨基酸，可能形成球形结构(Dure et al.，1989，Ingram and Bartels，1996)。

发明内容
1、克隆了新的脱水素基因BcDh2我们从干旱诱导的厚叶旋蒴苣苔(B.crassifolia)的叶片中分离出一个新的脱水素类似基因cDNA，命名为BcDh2(GenBank登录号为AY243045)。BcDh2编码区(codingsequence)为402bp。该基因编码一条由133个氨基酸组成的多肽—一个典型的YSK2型脱水素，在氨基末端具有一个Y-区段，中部为7个丝氨酸组成的S-区段，羧基末端含有两个重复排列的K-区段。根据已知的植物脱水素基因保守区域设计引物，采用DDRT-PCR方法从厚叶旋蒴苣苔总RNA中扩增出一个300bp与植物脱水素基因同源的序列。利用5’RACE技术获得了植物脱水素基因家族的一个新成员BcDh2的全长cDNA(402bp)，并对该基因的表达特性进行了分析。Southern杂交分析表明BcDh2基因在厚叶旋蒴苣苔基因组中以单拷贝形式存在。Northern杂交分析指出，BcDh2基因在正常生长的植物体中是不表达的，但在不同的环境胁迫(干旱，低温，热击)和外源诱导物(外源ABA，MeJA和SA)存在条件下的积累是不同的。BcDh2转录子在干旱，高盐，温和的热击和外于外源ABA诱导下强烈表达，但对低温，MeJA和水杨酸处理有微弱表达，这些结果指出BcDh2基因在胁迫和伤害反应中的作用。
2、构建了BcDh2基因的植物表达载体将BcDh2基因置于CaMV 35S启动子调控下，构建了植物表达载体pBI121BcDh2。通过冻融法转化土壤农杆菌LBA4404，再利用叶盘法转化烟草得到了转基因烟草植株。将BcDh2基因置于Ubiquitin启动子调控下，构建了单字叶植物表达载体pAHC-BcDh2和p3ubiBcDh2。通过基因枪转化草坪草和牧草，得到转基因植株，并初步表现耐旱耐寒性能提高。
3、克隆了该脱水素基因的上游调控区，并命名为启动子BcDh2P通过连接介导PCR的方法，克隆到BcDh2基因上游的一段1084bp的序列BcDh2P，将它连接到含有GUS报告基因的中间表达载体pCAMBIA1350中，对转基因烟草中GUS表达的分析表明，BcDh2P该能对ABA、干旱和寒冷做出反应。
4、通过基因枪和农杆菌介导的方法对草坪草和牧草进行了遗传转化，并获得了耐旱转基因草坪草和牧草将BcDh2基因置于在单子叶中高效表达的Ubi启动子驱动下，通过基因枪的方法导入广泛应用的草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草中，使草坪草和牧草的耐旱性显著提高，对于解决城市绿化中草坪耗水量大与我国水资源形势严峻的矛盾有重要意义。目前已获得转基因草坪草，并已初步表现出增加耐缺水能力，有助于解决草坪草耗水量大、养护困难的问题。因此这一转基因草坪草在节约城市绿化用水方面很有潜力。
这里应特别指出的是，虽然在本发明的下述实施例中以转基因烟草、草坪草(包括早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根等)和牧草(包括苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草等)的产生及检测举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味本发明制备的脱水素BcDh2基因及其所用的植物表达载体只用于转化和产生表达BcDh2基因编码蛋白的烟草、早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草，还包括其它草坪植物和牧草。因为本领域的技术人员可以利用本专利构建好的BcDh2基因表达载体，利用本专利提供的植物遗传转化方法转化其它草坪植物和牧草植物。
在本发明的一个实施方案中，BcDh2基因置于组成型表达启动子CaMV35S启动子的调控之下，构建了适合于双子叶植物转化的植物表达载体pBI121BcDh2。将连接在pGEM-TEasy载体上的BcDh2基因编码区用Nco I和Sac I切下来，连接到用Nco I和Sac I处理过的原核表达载体pET-30a上，构建表达BcDh2蛋白的质粒pET-30aBcDh2，转化大肠杆菌E.coli DH5α菌株，筛选正确的克隆。用Bgl II和Sac I消化质粒p30aBcDh2，回收BcDh2片段，将它连接到用BamH I和Sac I消化过的质粒pBI121中，形成pBI121BcDh2。
根据本发明的这一个实施方案，驱动BcDh2基因的启动子除了组成型表达启动子CaMV35S外，还应包括其它目的是为了驱动BcDh2基因在植物中高效表达的启动子如泛素Ubiqutin启动子，actin启动子等。
根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体为pBI121表达载体，其植物筛选标记基因为NPTII，编码新霉素磷酸转移酶蛋白，具有抗卡那霉素的作用。NPTII编码区的启动子为CaMV35S启动子，终止子为CaMV35S polyA。驱动BcDh2基因的启动子为CaMV35S启动子，终止子为nos polyA。
根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体除了pBI121表达载体外，还可以选用CAMBIA公司的pCAMBIA系列载体或者本领域技术人员所构建的其它常用的植物表达载体如pGPTV系列，pCB系列等。这些植物表达载体的标记基因为hptII、NPTII和bar。HptII基因的编码产物提供了潮霉素抗性功能，NPTII基因的编码产物提供了卡那霉素抗性功能，bar基因的编码产物提供了除草剂抗性功能。
在本发明的一个实施方案中，BcDh2基因置于Ubiquitin(泛素蛋白基因的5’端调控区，在单子叶植物中组成型表达)启动子的调控之下，构建了适合于单子叶的植物表达载体pAHC-BcDh2。将连接在pGEM-T Easy载体上的BcDh2基因编码区用Nco I和Sac I切下来，连接到用Nco I和Sac I处理过的原核表达载体pET-30a上，构建表达BcDh2蛋白的质粒pET-30aBcDh2，转化大肠杆菌E.coli DH5α菌株，筛选正确的克隆。用Bgl II和Sac I消化质粒p30aBcDh2，回收BcDh2片段，将它连接到用BamH I和Sac I消化过的质粒pAHC25中形成pAHC-BcDh2。该表达载体由于没有LB(Left Border)、RB(RightBorder)，因此不能通过农杆菌介导的方法转化植物，而采取基因枪的方法转化植物。
根据本发明的这一个实施方案，BcDh2基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，bar基因的启动子亦为Ubiquitin，终止子为Tnos。
在本发明的一个实施方案中，BcDh2基因置于Ubiquitin启动子的调控之下，构建了适合于用农杆菌转化的植物双元表达载体p3ubiBcDh2。用Apa I切pTRD，补平，用SpeI切下ubiquitin启动子(2.0kb)，亚克隆到pBluescript KS(+)EcoR V和Spe I位点间得到质粒pBRD；pBRD用Xba I和Sac I消化后，连上用Xba I和Sac I从质粒pT-BcDh2上切下的BcDh2(0.7kb)片段得质粒pBRDI；用HindIII和Sac I消化pBRDI，回收ubiquitin启动子和BcDh2基因的融合片段(2.9kb)，将它与Hind III和Sac I消化pCAMBIA3300回收的大片段连接，得到ubiquitin启动子驱动BcDh2基因的植物双元表达载体p3ubiBcDh2。
根据本发明的这一个实施方案，BcDh2基因的启动子为Ubiquitin，终止子为Tnos；筛选标记基因为Bar，bar基因的启动子为2xCaMV35S，终止子为Tnos。
根据本发明的这一个实施方案，该植物表达载体既可以通过农杆菌介导的方法遗传转化植物，亦可以通过基因枪的方法转化植物。
根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体为CAMBIA公司的pCAMBIA3300表达载体，其植物筛选标记基因为Bar，bar基因的编码产物提供了除草剂(草丁膦)抗性功能。
根据本发明的这一个实施方案，构建所选用的原始植物表达载体除了CAMBIA公司的pCAMBIA3300表达载体外，还可以选用CAMBIA公司的其它表达载体或者本领域技术人员所构建的其它常用的植物表达载体如pGPTV系列，pBI系列pCB系列等。
在本发明的一个实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化烟草、草坪草和牧草。
根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株为LBA4404。
根据本发明的这一个实施方案，所选用的农杆菌菌株除了LBA4404外，还应包括农杆菌的其它菌株。这些菌株的特征是本身含有Vir毒性蛋白区，能够帮助转入的植物表达载体中的T-DNA转移到植物的基因组中。
在本发明的一个实施方案中，转化烟草、草坪草和牧草的一种方法为农杆菌介导法。
根据本发明的这一个实施方案，植物筛选所用的抗生素除了卡那霉素，还包括除草剂，具体选用何种筛选要看选用植物表达载体所对应的标记基因。如选用pBI121BcDh2载体则筛选标记为卡那霉素(Km)，选用pAHC-BcDh2和p3ubiBcDh2载体则筛选标记为除草剂。
在本发明的一个实施方案中，转化草坪草和牧草的另一种方法为基因枪法。
根据本发明的这一个实施方案，用于基因枪转化的载体质粒主要是pAHC-BcDh2和p3ubiBcDh2。这两种载体的植物筛选标记均为除草剂。
本发明用于靶植物的实际转化方法除了农杆菌介导法和基因枪法，还可以使用本领域技术人员所熟知的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但并不仅限于农杆菌介导法，微粒轰击法(即基因枪法)，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。本领域技术人员可以通过参考有关文献得到详情。最好使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。
本发明的有益效果BcDh2基因受干旱和寒冷诱导表达，其编码蛋白脱水素在植物干旱情况下与细胞内一些糖醇类小分子协同作用，保护细胞膜和生物大分子，从而帮助植物细胞抵抗干旱胁迫，提高植物的耐旱性。将BcDh2基因导入草坪草和牧草植物后，能有效提高转基因植物的耐旱保水能力。转基因株系在离体条件下与未转基因对照株系相比，6小时后保水力提高20～33％，9小时后保水力提高22～50％。在田间种植条件下转基因株系比未转基因对照节水25～40％。
四、附图简要说明


图1是表示植物表达载体pAHC-BcDh2构建流程的示图。
图2是表示植物表达载体p3ubiBcDh2的示图。
图3是BcDh2基因转化草坪草和牧草的PCR检测。
图中扩增条带大小为0.7kb，电泳带从左到右编号依次为M，1，2，3，4。M表示分子标记Marker，1为负对照，2为正对照，3，4为不同转基因株系。
图4是BcDh2基因转化草坪草和牧草的Southern检测。
图中谱带大小为0.7kb，从左到右编号依次为1，2，3，4，5。1为正对照，5为负对照，2，3，4为不同转基因株系。
图5是转BcDh2基因草坪草和牧草的Northern boltting检测。
图中谱带大小为0.7kb，从左到右编号依次为1，2，3，4。1为负对照，4为正对照，2，3为不同转基因株系。
图6是转BcDh2基因草坪草和牧草的保水力曲线。
横坐标为离体叶片小时数，纵坐标为叶片含水量百分比。◆表示非转基因对照，●■▲表示三种不同转基因株系。
五具体实施例方式所有实施例中的细菌培养和DNA操作均参考《分子克隆实验室操作指南》(金冬雁等译，科学出版社，北京(1993))和《精编分子生物学指南》(颜子颖等译，科学出版社，北京(1998))。分子操作中的工具酶如限制性内切酶均购自Promega公司，NewEnglandBiolabs公司。
实施例1 BcDh2基因的克隆根据脱水素类基因富含赖氨酸的保守区EKKGIMD(E)KIKEKLPG设计简并引物，用GSP1和mRNA 3’端的锚定引物43218 5’GCG GCC GCT(18)3’。采用TRIzol试剂从干旱胁迫处理后的厚叶旋蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)提取叶片总RNA，加DNaseI消化去除残存DNA，用引物43128逆转录合成cDNA第一链后用引物GSP1和43128进行PCR反应。样品经94℃预变性5min，然后按照下列参数进行PCR.94℃30s，53℃30s，72℃ 20s，30个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收特异片段，连入pGEM-T Easy载体，送北京博亚生物技术公司进行序列测定。
为了通过5’RACE的方法获得BcDh2基因的5’端，参照文献(Kimura Y et al，1996)合成上游引物(46121)5’GGC CCGACGTCGCATG 3’和锚定引物(46122)5’GGC CCGACG TCG CAT GAA TTC(12)3’，基因特异引物(GSP2)5’TTG GAT TCT CAG TGGCAT GC 3’和(43514)5’TAC ACT TCC TCG GTC TTC TTG 3’。采用TRIzol试剂从干旱胁迫处理后的厚叶旋蒴苣苔提取叶片总RNA，加DNaseI消化去除残存DNA，用引物GSP1逆转录合成总cDNA第一链，玻璃奶纯化后用磷酸转移酶将polyA加到cDNA链的5’末端，接着以加尾的cDNA链为模板PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收特异片段，连入pGEM-T Easy载体，送北京博亚生物技术公司进行序列测定。
细菌质粒DNA的制备(1)挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；(2)取1.5ml菌液于小离心管中，10,000rpm离心30秒；(3)菌体沉淀重悬于100ul溶液I(50mM蔗糖，20mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))中，振荡混匀并静置数分钟；(4)加入新鲜配置的200ul溶液II(0.2N NaCl，1％SDS)，轻弹混匀，冰上放置3分钟；(5)加入预冷的150ul溶液III(60ml 5M KAc，11.5ml冰乙酸，28.5ml无菌水)，轻弹混匀，冰上放置5分钟；(6)12,000rpm离心5分钟；(7)取上清液，加入1倍体积的异丙醇，混匀后在冰上放置10分钟；(8)12,000rpm离心5分钟，弃去上清后稍微晾干，使之溶于200ul无菌水；(9)加入100u17.5M醋酸铵，轻轻混匀后在冰上放置10分钟；于12,000rpm离心5分钟；(10)取上清液，加入两倍体积无水乙醇后，于冰上或-20℃放置20分钟，12,000rpm离心15分钟；(11)沉淀用70％乙醇清洗，抽干后溶于TE缓冲溶液(10mM Tris.Cl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0))中。
质粒酶切条件
30ul反应体系中，加入10×酶切缓冲液3ul，DNA 1-5ug，限制性内切酶1ul(10U)，加无菌双蒸水补至30ul，37℃反应1-2小时，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
DNA片段的回收(1)从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段(体积不要超过100ul)置于小离心管；(2)加入3倍体积的溶胶液，60℃水浴5分钟，其间轻摇小离心管数次使胶完全溶化；(3)加入10ul玻璃奶，用加样器混匀。室温静置5分钟；(4)离心，3,000rpm数秒，吸弃上清；(5)加125ul漂洗液，混匀。离心弃上清；(6)重复第五步两次；(7)加适量无菌蒸馏水或TE缓冲液，混匀；(8)60℃水浴5分钟；(9)15,000rpm离心数秒。回收上清备用。连接10ul反应体系中加入5∶1比例量的插入片段和载体片段，1单位T4DNA连接酶，16℃放置10小时左右。
大肠杆菌感受态细胞的制备(1)挑取E.coli DH5α单菌落接种于100ml液体培养基中，37℃培养至OD600约0.4；(2)冰浴10分钟，分装于无菌离心管中，4℃，4,000rpm离心5分钟收集细胞；(3)重悬于600ul冰预冷的0.1M CaCl2中，冰浴30分钟；(4)4℃，4,000g离心10分钟收集细胞。用100ul预冷的0.1M CaCl2重悬细胞沉淀，待用。
感受态细胞的转化(1)取100ul感受态细胞加5ul连接产物，轻轻混匀，冰置30分钟；(2)于42℃水中热激90秒，迅速置于冰上冷却1-2分钟；(3)加200ul LB液体培养基，37℃振荡培养45分钟至1小时；(4)均匀涂布于含适当抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
重组质粒的筛选与鉴定a.蓝白斑筛选对于载体上含有lacZ基因的重组质粒，可以利用x-Gal/IPTG选择培养基进行初步筛选，没有插入外源片段的自身环化质粒菌落为蓝色，插入外源片段的重组质粒转化子为白色菌落；b.酶切鉴定挑取单菌落于含适当抗生素的3ml LB液体培养基中，37℃培养过夜提取质粒DNA，用适当限制性内切酶进行酶切以判断是否为阳性克隆；c.PCR检测以质粒DNA为模板，用特定引物在适当条件下做PCR扩增反应，电泳检测是否有特异条带。
实施例2 BcDh2基因5’端调控区BcDh2P启动子的克隆厚叶旋蒴苣苔总DNA分别用BamH I、Bgl II、Bcl I、Xho I和Sal I酶切，连上相应的接头，两轮PCR后只有经过Xho I处理的厚叶旋蒴苣苔总DNA能扩增出特异片断，将该片段琼脂糖凝胶电泳回收连接到pGEM-T Easy载体上，筛选阳性克隆并测序。染色体步行法得到的BcDh2基因上游调控区长为1084bp。将该启动子驱动GUS报告基因构建植物表达载体，通过干旱、寒冷及ABA诱导等不同处理，检测GUS基因的活性，发现该启动子能受干旱、寒冷及ABA的诱导。
操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定均按照实施例1所述步骤进行。
实施例3 BcDh2P启动子驱动GUS报告基因植物表达载体的构建通过染色体步行法得到的BcDh2基因上游调控区长为1084bp。将该启动子驱动GUS报告基因构建植物表达载体，通过干旱、寒冷及ABA诱导等不同处理，检测GUS基因的活性，发现该启动子能受干旱、寒冷及ABA的诱导。GUS组织染色显示转基因植株在干旱、寒冷和ABA诱导下起GUS阳性反应(染出蓝色)。
实施例4 植物表达载体pBI121BcDh2的构建将连接在pGEM-T Easy载体上的BcDh2基因编码区用Nco I和Sac I切下来，连接到用Nco I和Sac I处理过的原核表达载体pET-30a上，构建表达BcDh2蛋白的质粒pET-30aBcDh2，转化大肠杆菌E.coli DH5α菌株，筛选正确的克隆。用Bgl II和Sac I消化质粒p30aBcDh2，回收BcDh2片段，将它连接到用BamH I和Sac I消化过的质粒pBI121中，形成pBI121BcDh2。
操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定均按照实施例1所述步骤进行。
实施例5 植物表达载体pAHC-BcDh2的构建将连接在pGEM-T Easy载体上的BcDh2基因编码区用Nco I和Sac I切下来，连接到用Nco I和Sac I处理过的原核表达载体pET-30a上，构建表达BcDh2蛋白的质粒pET-30aBcDh2，转化大肠杆菌E.coli DH5α菌株，筛选正确的克隆。用Bgl II和Sac I消化质粒p30aBcDh2，回收BcDh2片段，将它连接到用BamH I和Sac I消化过的质粒pAHC25中形成pAHC-BcDh2。
操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定均按照实施例1所述步骤进行。
实施例6 植物表达载体p3ubiBcDh2的构建用Apa I切pTRD，补平，用Spe I切下ubiquitin启动子(2.0kb)，亚克隆到pBluescriptKS(+)EcoR V和Spe I位点间得到质粒pBRD；pBRD用Xba I和Sac I消化后，连上用XbaI和Sac I从质粒pT-BcDh2上切下的BcDh2(0.7kb)片段得质粒pBRDI；用Hind III和Sac I消化pBRDI，回收ubiquitin启动子和BcDh2基因的融合片段(2.9kb)，将它与HindIII和Sac I消化pCAMBIA3300回收的大片段连接，得到ubiquitin启动子驱动BcDh2基因的植物双元表达载体p3ubiBcDh2。
操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定均按照实施例1所述步骤进行。
实施例7 土壤农杆菌的转化土壤农杆菌感受态的制备(1)将土壤农杆菌菌株LBA4404接种于含适当抗生素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养至对数期；(2)4℃，8,000rpm离心5分钟，收集菌体于小离心管中；(3)用600ul冰预冷的500mM CaCl2重悬洗涤细胞；(4)4℃，8,000rpm离心5分钟，细胞沉淀中加入200ul冰预冷的500mM CaCl2，混匀后备用(24hr至48hr使用最佳)；土壤农杆菌的转化
(1)分别加入约1ug构建好的植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，于液氮中速冻5分钟，然后37℃温育5分钟；(2)加入600ul YEB液体培养基，28℃轻摇2-4小时；(3)取200ul菌液均匀涂布于含适当抗生素的YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。挑几个菌落进行PCR检测，得到阳性菌株。
实施例8 烟草的遗传转化及植株再生烟草的遗传转化采用叶盘法。
叶盘法转化烟草及植株再生(1)接种农杆菌单菌落于含适当抗生素的2ml YEB液体培养基中，28℃培养1-2天，转接入40ml YEB液体培养基中，28℃继续培养至OD600约0.5，8,000g离心10分钟，菌体用40ml MS液体培养基重新悬浮。
(2)取无菌烟草叶片和不含腋芽的茎段，于MS固体培养基中25℃预培养一天。
(3)重新取出材料，用剪刀切成小块放入无菌MS液体培养基稀释过的农杆菌中，浸泡15-20分钟，其间轻摇几次。
(4)用无菌滤纸吸去多余菌液，于烟草培养基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Km(5.0)+Cb(500)，单位为mg/L]中25℃暗培养两天。
(5)把材料转入烟草培养基[MS+BA(0.5)+NAA(0.1)+Km(5.0)，单位为mg/L]中，25℃光照培养至分化出愈伤组织，直至长出芽；每14-20天继代培养一次；(6)将长至3-5cm的芽转入烟草生根培养基[1/2MS培养基]上诱导生根；(7)约2-3周后根系形成，移栽于灭菌的土壤中培养。
PCR检测和Southern检测证明BcDh2基因整合到烟草的基因组中，Northern boltting检测证明BcDh2基因在转基因植物中正常转录，保水力测定显示转基因株系比未转基因对照保水力明显提高。
实施例9对草坪草和牧草的遗传转化农杆菌介导法(1)成熟种子用0.1％升汞消毒后，先接于N6基本培养基上，让其萌动3天，露出小芽时，将胚纵切后转接于诱导愈伤组织培养基上，形成愈伤(约30天左右)后，每次挑选色泽鲜、增殖快、质地硬的愈伤组织继代培养。
(2)接种农杆菌单菌落于含适当抗生素的2ml YEB液体培养基中，28℃培养1-2天，转接入40ml YEB液体培养基中，28℃继续培养至OD600约0.5，8,000g离心10分钟，菌体用40ml MS液体培养基重新悬浮。
(3)重新取出材料，用剪刀切成小块放入无菌MS液体培养基稀释过的农杆菌中，浸泡15-20分钟，其间轻摇几次。
(4)用无菌滤纸吸去多余菌液，于烟草培养基[N6+BA(0.5)+NAA(0.1)+Km(5.0)+Cb(500)，单位为mg/L]中25℃暗培养两天。
(5)把材料转入烟草培养基[N6+BA(0.5)+NAA(0.1)+Km(5.0)，单位为mg/L]中，25℃光照培养至分化出愈伤组织，直至长出芽；每14-20天继代培养一次；(6)将长至3-5cm的芽转入烟草生根培养基[1/2MS培养基]上诱导生根；(7)约2-3周后根系形成，移栽于灭菌的土壤中培养。
基因枪法转化过程包括种子或幼穗(包括草坪植物如早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根以及牧草如苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草)诱导愈伤组织、基因枪轰击、抗性愈伤筛选、苗的分化、植株鉴定。
种子诱导愈伤的步骤成熟种子用0.1％升汞消毒后，先接于MS基本培养基上，让其萌动3天，露出小芽时，将胚纵切后转接于诱导愈伤组织培养基上，形成愈伤(约30天左右)后，每次挑选色泽鲜、增殖快、质地硬的愈伤组织继代培养，继代愈伤可供基因枪转化；幼穗诱导愈伤的步骤取长约0.2～1cm左右的幼穗，用70％乙醇表面消毒后，在超净台内剥出幼穗，接种于诱导诱导培养基上，形成愈伤后，每20天继代培养一次，供基因枪转化；基因枪的转化及苗的分化质粒提取的质粒浓度调整为1μg/μL。子弹配制30mg金粉或钨粉加1mL 100％乙醇旋涡洗涤15分钟，无菌水洗3次，加500μL 50％甘油备用。取上述钨或金粉悬液50μL，加5μL DNA，加50μL 2.5M CaCl2，加20μL 0.1M亚精胺，旋涡，冰上静置15分钟，离心数秒，70％乙醇142μL洗一次，离心数秒，100％140μL乙醇洗一次，离心数秒，加50μL 100％乙醇，供5枪用。
供试基因枪PDS-1000/He(美国伯乐公司)基因枪可裂膜用1350Psi可裂膜，真空度25 InHg，6cm射击距离，每皿射击一枪。枪击前的愈伤组织在含0.4M甘露醇的继代培养基上培养4～8小时，枪击16小时后移入正常继代培养基。枪击后的愈伤组织一周后转至含除草剂2-5mg/L的继代筛选2～4轮，每轮20天。筛选后得到的抗性愈伤组织转入含50g糖的培养基中，光照培养20天，然后转入去掉2，4-D的分化培养基中分化成苗。当小苗长到4-5片叶时，取少量叶片提取植物总DNA，进行PCR检测。小苗长至5～10cm大小时，移入蛭石∶松针土为1∶1的土中，塑料袋保温一周后，苗即成活。
实施例10 转基因植株的鉴定与检测植物基因组DNA的制备(1)称取0.1g植物叶片或茎组织，于研钵中快速用液氮研至粉末并转入1.5ml离心管中，立即加入500ul的提取缓冲液(500mM NaCl，50mM Tris-Cl PH8.0，50mM EDTA，1％(V/V)β-巯基乙醇)，轻轻混匀；(2)解冻后放置于冰上，加入冰冷20％存贮液PVP(存于-20℃)至终浓度为6％。
(3)加入50ul 20％SDS，轻轻混匀后于65℃水浴10分钟；(4)加入250ul 5M KAc于冰上反应30分钟，离心(15000rpm，10分钟，4℃)。
(5)取上相转入一新的离心管，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀三次，再置于冰上10分钟。离心(15000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清；(6)沉淀物抽真空或室温吹干后，溶解于500ul 1×TE(pH8.0)。用1倍体积的饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一至两次，取上相；(7)离心(12000rpm，10分钟，20℃)，取上相转入一新的离心管；(8)加入1倍体积的异丙醇(20℃，5分钟)，并将管至少颠倒5次；(9)离心(15000rpm，10分钟，4℃)，用70％乙醇冲洗沉淀物，抽真空或吹干，最后溶于适量TE(pH8.0)中。
转基因草坪草和牧草的PCR鉴定得到抗生素筛选阳性的转基因草坪草和牧草(早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草)后，在生长初期，取转基因植株叶片并用SDS法提取植株的总DNA进行PCR鉴定，以合成的BcDh2基因特异性引物(p15’AGGATCCATATGGAGCCATACGGGAACCA 3’；p25’GGCAG GTATGCTCGGACACA 3’)进行PCR扩增，可以得到约700bp的条带，说明BcDh2基因已整合至转基因植株的基因组。(见图5转基因草坪草和牧草的PCR鉴定)实施例11 转基因植株的Southern检测
酶切及电泳提取植物总DNA，取10ug用限制性内切酶消化过夜，电泳检测是否酶切完全，以3V/cm恒压电泳4-6小时。
转膜(1)将凝胶的加样孔及不含样品的多余部分切掉，在0.25M HCl中浸泡10分钟；(2)用蒸馏水稍冲洗后，浸于变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中室温变性2次，每次15分钟，其间轻摇数次；(3)用蒸馏水稍冲洗后，浸于中和液(0.5M Tris.Cl，pH7.4，1.5M NaCl)中于室温中和2次，每次15分钟，其间轻摇数次；(4)用蒸馏水稍冲洗后，浸于10×SSC缓冲溶液中10分钟，其间轻摇数次；(5)在一个较大可以密封的容器中进行转膜；(6)在该容器底部铺上4-7cm的吸水纸，在上面铺三层被10×SSC缓冲溶液微微蘸湿的Whatman 3MM滤纸；(7)凝胶块切除一角作记号正面朝上放于滤纸上，赶除气泡；(8)上面铺五张完全浸润10×SSC缓冲溶液的Whatman 3MM滤纸，密封容器转膜约4小时；(9)转膜结束后将尼龙膜在空气中晾干，用紫外交联仪进行交联。
探针的标记和制备在50ul反应体系中加入5ul 10×PCR buffer，各50pmol引物，1ul dNTP，1ul Taq酶，0.1ul DIG-labeled-dUTP，100pg模板DNA。反应条件根据不同的模板稍有变动。反应结束后电泳检测，标记后的探针比没有标记的产物分子量大。95℃煮5分钟，迅速移至冰水中，-20℃保存备用。
杂交和检测(1)将转移后的尼龙膜置于杂交袋中，放于预杂交液中(10ml/100cm2膜)，赶尽气泡，68℃保温4小时；(2)弃去预杂交液，按2.5ml/100cm2膜的量加入杂交液，杂交液中含DIG标记的探针(2ulDIG探针/1ml杂交液)，68℃杂交16小时；(3)用2×漂洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗膜2×5分钟；(4)用0.1×漂洗液(0.1×SSC，0.1％SDS)68℃洗膜2×15分钟；
(5)将膜在Buffer I(0.15M NaCl，0.1M马来酸，调pH＝7.5)中平衡1分钟；(6)在Buffer II(Buffer I中加入1％封闭剂)中室温轻摇30分钟；(7)取anti-DIG-AP，13000rpm离心5分钟，按1∶2000稀释于Buffer II中，取20ml该溶液浸泡尼龙膜，室温轻摇30分钟。
(8)用20mlBuffer I洗膜2×15分钟。
(9)在Buffer III(0.1M Tris-HCl pH9.5，0.1M NaCl，0.15M MgCl2)中平衡2-5分钟；(10)按1∶500把检测底物稀释于Buffer III中，把膜在室温下暗处静置反应，当预期条带显现后，立即用Buffer I终止反应。
实施例12 转基因株系的保水力测定称取0.2g转基因和对照样品置于干燥器中，每3小时(3hr，6hr，9hr)测定其重量，24小时再测定重量。
计算保水力值(1-失水量/鲜重)×100％选取具有除草剂抗性、PCR鉴定和Southern阳性的转基因植株及未转基因对照进行保水力测定。结果显示不同的转基因株系在离体条件下保水力均高于对照(见表1)，6小时后保水力提高20～33％，9小时后保水力提高22～50％。
实施例13 不同转基因草坪草和牧草株系的节水性试验将不同转基因草坪草和牧草株系以及未转基因对照均置于旱棚中(防止天然降雨，可通过人工灌溉控制对试验植物的给水量)，经过7～10天的炼苗后同时浇足一次水，之后不再接受天然和人工降水，直到植物叶片开始出现中度萎蔫。测定不同株系萎蔫的天数，节水百分比＝[(转基因株系萎蔫天数—对照株系萎蔫天数)/对照株系萎蔫天数]×100％统计不同转基因株系的节水百分比，发现转基因株系比未转基因对照能节水25～40％。(见表2)
表1不同转BcDh2基因植物株系在3、6、9、24小时的保水力3小时6小时9小时24小时CK 83％ 58.5％ 46％ 20％不同株系 93.5％ 71.9％ 60.1％ 24％不同株系 98.4％ 78.6％ 68％ 30.4％不同株系 90％ 65.5％ 54％ 24％表2不同转基因株系的节水百分比

表3农杆菌YEB培养基配方成分每升含量(克)牛肉膏提取物 5.0酵母提取物 1.0蛋白胨 5.0蔗糖 5.0MgSO4.7H2O 0.5琼脂(固体培养基用) 10
实施例4除用糖蜜替代工业葡萄糖，细胞生长阶段的pH＝5.2，表达阶段的pH＝4.4外，其他条件与实施例1相同。
以本发明的碳源和氮源进行细胞生长培养时，细胞光密度(OD600)可达400-700，细胞干重为150g/L以上，达到高密度发酵的要求。本发明与现有技术相比的结果见下表表本发明细胞生长碳源和氮源与国内外发明生产植酸酶的比较

六、专利菌种说明此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli(DH5α))，保藏代号为pT-BcDh2，保藏编号为CGMCCNO.0838，保藏日期为2002年11月22日。
总之，本发明克隆了一个新的脱水素基因BcDh2和其启动子BcDh2P，并且利用此基因构建了多个植物表达载体，通过农杆菌介导和基因枪法遗传转化获得了耐旱节水转基因植物。PCR检测和Southern检测证明该基因整合到转基因植株基因组中，Northern Blotting检测证明该基因能在植物中高效表达，保水力测定和节水性试验均证明转基因株系比对照显著提高了耐旱性，在草坪和牧业中具有重要意义，并且能够大规模放大生产。
<110>林忠平<120>脱水素基因BcDh2及其启动子在培育耐旱植物中的应用<150>CN02153276.1<151>2002-11-26<160>2<210>1<211>402<212>DNA<213>厚叶悬蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)<220>
<221>CDS<222>(1)...(402)<400>1atggagccat acgggaacca ccaaattggt gaccaattga ggaagactga tgagtatggc 60aaccccgtcc accacacgcc tggaggagaa tacggcggac ctcatgttgg agccgaacat 120caccatggtg ctcctatttc gattcccccc accaccgatg tcccccacca ccgtcgatcc 180ggcagctcaa gcagctcgtc ttctgaggac gacgggcaag gtggtaggag aaagaagggg 240atcaaggaca aggtcaagga gaagctaccc ggcggccaca aagacaacca gccacatcac 300gaagcgggat acggcggagg ctacggcgcg caaccagaac ctgagaagaa ggggatgatg 360gacaaaatca aggagaaact gcctggcggc caccacaact aa402
<210>2<211>1084<212>DNA<213>厚叶悬蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)<220>
<221>Promoter<222>(1)...(1084)<400>2ggatccgtat ggacatttct atactatgaa aatccttttg agtggttcaa cagatgtcgg 60atcgagaaaa agaattttac tgttgacaac tgtcgagttt ggtttgggaa ccatctcaag 120ctaaaatatt tcgaaaagag tttcaagagt ttattcacgt aatttaaatt ctgaacccga 180tcctaacagt gtaagtaaat tcagtagaag tttatatact tcggtgcttg gttgatgaat 240aaatttcgtt gaaaggcaac tgattaaaca aacgtagaac tgaaggtata ttagacctat 300atatccacgt gagtgttcca tgttaagaga aacacaatcc tacacgagtc atgggcactg 360ggcagtctgg aatgggtaga gttgtaattt cacaatattt ccccatcaat ttgatcgatt 420ttgagtttta atctaataaa ttttcaaaat tcgattttaa taaaatattt ttaattttta 480tgcattttga tcaaattatt aatatgacat cgataaatat taaaataaca acgaaaaata 540atgatattac atcgaaaaat actaatatca tataaaatat tgttaagtaa ttagatatca 600catcaaataa gataaataaa ataaccaaaa aaaaatttaa tataccatta ccaactccaa 660aattaaacaa attaataaaa taaaaatatc attttccttt cgctacaaag aaaggtcaat 720atccttcttt cgaaatccag atacatgttt gatatattct attattctat caagtacacg 780tgcccttcta ttcggacaaa ggccaaagtt gcaaaagtac acgtatccta ataaaactta 840gctacgtgtc cacctacttc gctttcatcc gacgcttgtc ctgtccgagc tcattttcta 900ttaccacctt cacactatat atatccctca ctagctcgct ttctatatca cttgtatcac 960gcatcactct atcgaattgg agctatattc acttttgaac atcatttcat tttgaaacga 1020gaaggtacga aggctgatgg agccatacgg gaaccaccaa attggtgacc aattgaggaa 1080gaca 108权利要求
1.从厚叶旋蒴苣苔中克隆的脱水素基因BcDh2、其5’端调控区PBcDh2、部分如序列表所示的核苷酸序列和同源序列、以及利用这些核苷酸序列获得耐旱转基因植物的方法。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于该基因编码一条由133个氨基酸组成的多肽---一个典型的YSK2型脱水素，在氨基末端具有一个Y-区段，中部为7个丝氨酸组成的S-区段，羧基末端含有两个重复排列的K-区段。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于该基因5’端调控区PBcDh2具有序列表所示的1～1084bp序列或其部分序列。
4.适合在植物细胞中表达脱水素基因BcDh2的植物表达载体。
5.根据权利要求4所述的植物表达载体，其中包括说明书中提到的pBI121BcDh2载体、pAHC-BcDh2载体、p3ubiBcDh2载体。
6.根据权利要求4和5所述的植物表达载体，pBI121BcDh2载体的特征在于驱动BcDh2基因的启动子为CaMV35S，终止子为Tnos，筛选标记为NPTII基因，启动子为CaMV35S，终止子为CaMV35S polyA。
7.根据权利要求4和5所述的植物表达载体，pAHC-BcDh2载体的特征在于驱动BcDh2基因的启动子为Ubiqituin，终止子为Tnos，筛选标记为bar基因，启动子为Ubiqittuin，终止子为Tnos。
8.根据权利要求4和5所述的植物表达载体，p3ubiBcDh2载体的特征在于驱动BcDh2基因的启动子为Ubiqituin，终止子为Tnos，筛选标记为bar基因，启动子为Ubiqittuin，终止子为Tnos，目的基因和筛选标记基因两侧有左边界(Left Border，LB)和右边界序列(Right Border，RB)。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于利用获得的脱水素基因BcDh2或其启动子PBcDh2构建了植物表达载体，将这些植物表达载体直接通过基因枪法或通过农杆菌介导法导入植物细胞，生长出含有目的基因BcDh2的转基因植株。
10.根据权利要求1和9所述的方法，所指的植物是指烟草、早熟禾、高羊茅、黑麦草、紫羊茅、剪股颍、结缕草、狗牙根、苜蓿、沙打旺、百脉根、画眉草、冰草。
全文摘要
本发明克隆了厚叶悬蒴苣苔(Boea crassifoliaHemsl.)一个新的402bp长的脱水素基因及该基因5’端调控序列1084bp。该基因为脱水素家族YSK
文档编号A01H5/00GK1544631SQ20031011505
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月24日 优先权日2002年11月26日
发明者林忠平, 申业, 胡鸢雷, 倪挺 申请人:林忠平