专利名称：一种抗菌肽载体的构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达载体。具体而言，涉及通过将强抗菌活性的抗菌肽 Thanatin基因序列插入到增强型绿色荧光蛋白pIRES2_EGFP报告载体中，构建出 PIRES2-EGFP-Thanatin0本发明将重组表达载体通过睾丸注射，将抗菌肽Thanatin基因转入小鼠与绵羊，得到了抗菌能力强的子代动物。
背景技术：
抗菌肽(antibacterial ρ印tides)具有不同于传统抗生素的特殊作用机理，同时还具有抑杀一些病毒、寄生虫、肿瘤细胞的能力，已经成为一类具有巨大潜力的新型抗菌、 抗病毒、抗寄生虫和抗癌药物。抗菌肽分子量小、热稳定性和水溶性好，随着基因工程技术的发展以及对其研究的不断深入，研究人员开始探索将抗菌肽基因转入动、植物体内，以增强动、植物的防病抗病的能力。抗菌肽是指存在于生物体内，由生物细胞特定基因编码、具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽。上世纪七十年代，由瑞典科学家Boman等从惜古比天蚕(hyatophora cecropia)中首先发现抗菌肽，并将其称为天蚕素(cecropin)。此后不久Steiner等便首次从惜古比天蚕中分离出Cecropin蛋白(NCBI蛋白质数据库ID CAA29872)[Hultmark D, Steiner H, Rasmuson T, et al. Insect immunity :purifcation and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupa of Hyalophora Cecropina. Eur. J. Biochem，1980，106 :7_16]。人fl、]发现抗菌肽来源及其广泛，从植物、昆虫到两栖动物、哺乳动物(包括人类)都已被发现有抗菌肽的表达。迄今为止，已有近千种抗菌肽被相继分离、纯化(http://apS. unmc. edu/AP/main. php)。抗菌肽的种类繁多，但天然抗菌肽都具有以下共同特征①分子量小，大约为4KD 左右；②是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，多数等电点大于7，有较强的阳离子特性，并且对较大的离子强度和较高或较低的PH值均具有较强的抗性；③具有N端亲水，C端疏水的水脂两亲性质，其中N端是稳定区，富含有赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸残基，C端富含甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸等氨基酸残基，中间连接部分富含脯氨酸残基 [Jaynes J M，Burton C AiBarr S B,et al. In vitro cytocidal effect of novel lytic peptides on Plasmodium falciparum and trypanosom a cruzfi. FASEB J，1989，2 (12) 2878-2883.]；④绝大多数抗菌肽第2位均为色氨酸，它对杀菌活性至关重要；⑤在一定条件下形成α “螺旋和β “折叠结构，其中N端易形成α -螺旋，α -螺旋肽主要包括天蚕素 (cecropin)和爪蟾抗菌肽(magainin)等，而中间部分易形成β-折叠或铰链，β _折叠肽主要包括哺乳动物防御素、植物防御素、昆虫防御素和富含脯氨酸的抗菌肽等；⑥热稳定性好，在100°C加热10 15min能保持其活 性。抗菌肽主要是通过作用于细菌的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出胞外而死亡[Lee D G, Park Y, Kim H N, et al. Antifungal mechanism of anantimicrobial peptide，HP(2-20)，derived from N-terminus of Helicobacter pylori ribosomal protein Ll against Candida albicans. Biochem Biophys Res Commun,2002, 291(4) :1006-1013]。由于几乎所有的抗菌肽都是阳离子型的或两亲性的，对脂多糖(LPS) 具有较强的亲合作用，而LPS是革兰氏阴性菌(G-)外膜的主要组分，抗菌肽可通过竞争完全取代结合LPS的二价阳离子，从而导致外膜破坏，使抗菌肽得以通过外膜，并随后与带负电荷的磷脂膜结合，插入膜中。当达到一定浓度时，便形成非正式的跨膜通道，膜的完整性受到破坏，胞质内容物外泄，细菌死亡。对革兰阳性菌(G+)而言，由于其表面肽聚糖中存在带负电荷的胞壁酸、磷壁酸、糖醛酸和氨基酸羧基，因此抗菌肽也能与之结合，使肽聚糖层破坏而形成穿膜通道，致使细菌表面穿膜通道形成后，菌体内离子大量流出，最终导致细菌因高渗破裂而死亡。Oren等认为含α -螺旋结构的抗菌肽通常以“栅桶式”机制形成穿膜通道，而含折叠结构的抗菌肽则以“毯式”机制形成跨膜通道[Oren Z，Shai Y. Mode of action of linear amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers,1998,47(6) :451_463]。就抗菌肽穿越脂质双层的能力而言，含β-折叠结构的抗菌肽相对较高，含α-螺旋的居中，其他伸展肽类(extended peptides)相对较低。由于抗菌肽对细菌细胞壁的透过能力不同，因而不同种类抗菌肽对不同细菌的最小致死浓度也有很大不同[Friedrich C L, Moyles D, Beveridge T J, et al. Antibacterial action of structurally diverse cationic peptides on gram-positive bacteria. Antimicrob Agents chemother, 2000, (44) :2086_2092]。抗菌肽对于病毒、寄生虫和肿瘤细胞等同样具有一定的抑制杀灭作用，但其机理还不十分清楚，有待于研究人员的更深入的研究。抗菌肽在转基因动物中的研究起步较晚，目前还多以抗菌肽转基因小鼠的研究为主。Reed将小鼠IL-2基因与抗菌肽Shivala基因和SV40多腺苷酸化/剪接信号肽连接构建的融合基因[Reed W A, Elzer P H, Enright F Μ, et al. Interleukin 2 promoter/ enhancer controlled expression of a synthetic cecropin-class lytic peptide in transgenic mice and subsequent resistance to Brucella abortus. Transgenic Res, 1997，6 (5) 337-347]，注入小鼠原核期受精卵，获得26个转基因鼠系，然后用刀豆蛋白A刺激转基因小鼠的脾脏淋巴细胞，通过RT-PCR检测发现，其中2个转基因鼠系的脾脏淋巴细胞可被诱导转录、产生成熟的ShivalamRNA。再用一定量的布鲁氏杆菌感染攻击上述2个转基因成功的鼠系和非转基因对照组小鼠。4周后，检测小鼠脾脏组织中的布鲁氏杆菌数，结果发现转基因小鼠脾脏组织中布鲁氏杆菌数明显少于非转基因小鼠(P <0.05)，表明抗菌肽转基因小鼠获得了较强的抗菌 能力。Aliye等将重组cecropin B和cecropin Pl单细胞克隆入契努克鲑鱼胚胎细胞(CHSE-214)中，结果发现CHSE-214表达出来的天蚕抗菌肽对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、焚光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)与安圭拉弧菌(Vibrioanguillarum)等3种鱼类病原菌均有很强的杀伤力[Aliye Sarmasik, Thomas Τ. Bactericidal activity of cecropin B and cecropin Pl expressed in fish cells(CHSE-214) !application in controlling fish bacterial pathogens. Aquaculture, 2003，220 183-194.]。在国内，李华等以GFP基因与cecropin B突变体ABP-S1基因的融合基因PCMG构建了以pcDNA3. 1为载体的pcDNA3. 1-PCMG抗菌肽基因，通过显微注射法注射到FVB小鼠受精卵雄原核中，将存活的胚胎移植到假孕母鼠输卵管内发育产生子代小鼠，结果在生出的119只小鼠中经PCR和Southern检测到7只阳性小鼠[李华，董婉维，孙强等.抗菌肽转基因小鼠模型的建立.中国医科大学学报.2005,34(1) :4-5]。张舒构建了含CMV启动子和 BGHpolyA加尾序列的人B防御素2 (HBD-2)微基因，采用受精卵显微注射法建立了 HBD-2转基因小鼠模型，并通过RT-PCR和免疫组化检测显示HBD-2在其Fl代转基因小鼠生殖道、呼吸道、泌尿道以及血管内皮等组织部位广泛表达[张舒，黄宁，赵新宇等.HBD-2转基因小鼠的建立及鉴定.生物医学工程学杂志，2006，23 (2) :396-399]。 在迄今为止已知的众多昆虫抗菌肽中，Thanatin的抗菌谱最广、抗菌活性最强 [Fehlbaum P,Bulet P,Chernydsh S,et al. Structure-activity analysis of thanatin, a 21—residue inducible insect defense peptide with sequence homology to frog skin antimicrobial peptides. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93 :1221-1225]。Thanatin 是刺肩蝽(Podisus maculiventris)成虫经诱导产生的一种抗菌肽。由21个氨基酸残基组成，与青蛙皮肤中的抗菌肽brevinins有较高的同源性。该抗菌肽对革兰阳性、革兰阴性菌以及真菌都有很强的抗菌活性，因此被称为死亡素。Thanatin分子量小、热稳定、水溶性好与广谱抗菌等特点，因此通过基因工程技术将Thanatin基因转入动物体内将增强动、植物的防病抗病能力。为此借鉴已成功的其他抗菌肽转基因工程方法，把Thanatin基因转入畜禽特定细胞中表达，产生抗病新品种，为解决一直困扰畜牧业生产的细菌性和病毒性传染病的难题提供新的思路，意义重大。
发明内容
本发明公开了一种抗菌肽载体pIRES2-EGFP-Thanatin，所述载体包含基因序列 SEQ NO 1以及SEQ NO :2。所述的载体可以同时高效表达抗菌肽Thanatin以及绿色荧光蛋白 EGFP。本发明所述的载体可以增强小鼠的抗菌能力。本发明所述的载体可以增强绵羊的抗菌能力。本发明还公开了一种提高子代哺乳动物抗菌能力的方法，包括以下步骤1) PCR扩增技术得到完整的Thanatin基因，将其插入到pIRES2_EGFP报告基因中， 制备抗菌肽载体pIRES2-EGFP-Thanatin ；2)将抗菌肽载体pIRES2-EGFP-Thanatin、脂质体、生理盐水与台酚蓝混合，制备转染液；3)将哺乳动物麻醉消毒，采用微创手术，将上述转染液用分多点注射入哺乳动物两侧的睾丸中，直至睾丸的绝大部分实质变蓝；4)将微创手术后的雄性动物饲养一定时间，时间段为该雄性哺乳动物精原干细胞开始分化到精子完全成熟这个周期，之后再与雌性动物进行交配；5)使用488nm波长蓝光激发子代哺乳动物，筛选呈现绿色荧光的动物，呈现绿色荧光的是抗菌能力提高的子代动物。所述的方法与显微注射法不同，在以往的研究中，显微注射法获得的子代抗菌效率增加的阳性率较低，而本方法所产生的子代哺乳动物的抗菌比例明显增加。
图IThanatin基因的合成过程图与其序列图。图2pEASY_T3克隆载体结构示意图。图3pIRES2-EGFP_Thanatin重组表达载体示意图。图4Thantatin基因的PCR凝胶电泳图。其中M为DNA分子量标准，泳道1为 Thantatin —13。图5pIRES2-EGFP-Thanatin的鉴定。其中M为DNA分子量标准；泳道1为pEASY_T3 克隆载体的Xho I和Pst I双酶切；泳道2为重组质粒pIRES2-EGFP-Thanatin的Xho I和 Pst I双酶切；泳道3为重组质粒pIRES2-EGFP-Thanatin的Xho I单酶切。图6F1代1号鼠Fl代基因组DNA的PCR检测电泳图。其中M为DNA分子量标准； 泳道1为阴性对照；泳道2为阳性对照；泳道4、7、9为阳性后代样品；泳道3、5、6、8为阴性后代样品。图7F1代1号鼠PCR阳性后代的Southern印迹检测电泳图。泳道1为阴性对照； 泳道2为阳性对照；泳道3、4、5为阳性样品。图8转基因小鼠的荧光成像观察图。其中颜色较浅的部分为荧光鼠。实施例1睾丸注射法建立抗菌肽Thanatin转基因小鼠的研究一、试验材料1.试验动物昆明白小鼠，母鼠6-8周龄，公鼠8-10周龄，饲养在定期灭菌的控温鼠房中，温度控制在22°C，自动光控(12h明/12h暗)，自由采食和饮水。所有小鼠和鼠粮均购于中国军事科学院实验动物中心。2.主要仪器设备600z 电子天平(Tecator，Sweden)YJ-8755超净工作台(苏州净化设备公司)D-6450高温烤箱(高温烤箱)HX-1050恒温水浴仪北京博医康试验仪器有限公司Milli-Q 超纯水净化装置 Biocel 1，US5331 Mastercycler gradient PCR system(Eppendorf, Germany)5332 Mastercycler personal PCR system(Eppendorf, Germany)可调式微量移液器(Eppendoff，Germany)Centrifuge 5415 D 台式高速离心机(Eppendorf, Germany)Centrifuge 5810 R 高速冷冻离心机(Eppendorf, Germany)UV-2102 PC 紫外分光光度计(Nikon CMF-5OOz, Japan)GIS-2008 凝胶成像系统(Tanon)DDY-2C电泳仪(北京六一仪器厂)DYC-31D电泳槽(北京六一仪器厂)SIM-F122 制冰机(SANYO，Japan)MDF-192-80°C超低温冰箱(SANYO，Japan)TOMY SS-325 自动灭菌锅(SANYO，Japan)活体动物荧光成像系 统
3.主要试剂及配制1)主要试剂表1 主要试剂
权利要求
1.一种抗菌肽载体pIRES2-EGFP-Thanatin，其特征在于，所述载体包含基因序列SEQ NO 1 以及 SEQ NO :2。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽载体，其特征在于，所述载体可以增强小鼠的抗菌能力。
3.根据权利要求1所述的抗菌肽载体，其特征在于，所述载体可以增强绵羊的抗菌能力。
4.一种提高子代哺乳动物抗菌能力的方法，包括1)制备抗菌肽载体pIRES2-EGFP-Thanatin ；2)将抗菌肽载体、脂质体与台酚蓝混合制备转染液；3)采用微创手术，将上述转染液用分多点注射入哺乳动物两侧的睾丸中；4)将微创手术后的雄性哺乳动物饲养一定时间，时间段为该雄性动物精原干细胞开始分化到精子完全成熟这个周期，再与雌性哺乳动物交配；5)使用488nm波长蓝光激发子代哺乳动物，呈现绿色荧光是抗菌能力提高的子代哺乳动物。
全文摘要
本发明公开了一种抗菌肽载体。本发明通过将Thanatin基因序列插入到增强型绿色荧光蛋白pIRES2-EGFP报告载体中，构建出pIRES2-EGFP-Thanatin重组表达载体。本发明所述的载体pIRES2-EGFP-Thanatin可以增强小鼠与绵羊的抗菌能力。本发明还公开了一种提高子代哺乳动物抗菌能力的方法，具体而言，将所述的载体与脂质体混合，通过睾丸打点注射转染pIRES2-EGFP-Thanatin载体至睾丸内精原干细胞，建立了抗菌肽Thanatin转基因小鼠与转基因绵羊，提高了子代小鼠与绵羊的抗菌能力。
文档编号A01K67/027GK102220375SQ201110092189
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月13日 优先权日2011年4月13日
发明者苗向阳 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所