专利名称：Kctd10基因剔除小鼠模型、构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种KctdlO基因剔除小鼠模型、构建方法及其应用。
背景技术：
钾离子通道蛋白KctdlO是一个ΒΤΒ/Ρ0Ζ结构域蛋白，ΒΤΒ/Ρ0Ζ结构域最初在许多锌指蛋白、离子通道和其它功能蛋白中发现，它位于这些蛋白的N端介导蛋白质-蛋白质作用。在许多蛋白中，ΒΤΒ/Ρ0Ζ结构域参与蛋白同源寡聚体的形成，或形成异源寡聚体。在许多转录因子中，ΒΤΒ/Ρ0Ζ结构域与一些蛋白相互作用以调节转录活性。最近的研究表明，该结构域参与蛋白的泛素化水解。至今，在人体内已经发现有300多个ΒΤΒ/Ρ0Ζ结构域蛋白， 本领域迫切需要提供一种ΒΤΒ/Ρ0Ζ结构域蛋白敲除小鼠模型，它可以帮助研究者深入了解以KctdlO基因为代表的ΒΤΒ/Ρ0Ζ结构域蛋白的生物学功能提供有效的研究途径和方法，并由此提供其应用。小鼠已成为研究人类疾病的一种重要模式生物。Cre-IoxP系统，已经能够较为容易地实现基因敲除从而构建基因剔除小鼠模型。动物行为学及组织化学的迅速发展，以及实验室高新技术手段给予了我们从一个生物整体的角度研究基因功能的良好平台。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种钾离子通道蛋白KctdlO基因剔除小鼠模型，为研究ΒΤΒ/Ρ0Ζ结构域蛋白的生物学功能提供研究模型。本发明的目的之二在于提供该模型的构建方法。本发明的目的之三在于提供该模型在筛选促进胚胎发育中的应用。本发明的目的之四在于提供该模型在筛选促进血管生成中的应用。本发明的目的之五在于提供该模型在筛选促进心脏发育中的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种与心脏、血管发育密切相关的钾离子通道蛋白KctdlO基因剔除小鼠模型。一种构建上述的钾离子通道蛋白KctdlO基因剔除动物模型的方法，该方法的具体步骤为利用Cre-IoxP系统，将打靶载体电击转化胚胎干细胞，使其与基因组发生同源重组。再将阳性胚胎干细胞移植入胚胎，产生在KctdlO基因的两侧带有IoxP位点的后代， 将这些后代与表达Cre重组酶的小鼠杂交，就会产生KctdlO基因剔除小鼠模型。上述KctdlO基因剔除小鼠模型在筛选治疗早期胚胎发育滞后药物中的应用。上述KctdlO基因剔除小鼠模型在筛选治疗早期胚胎血管发生受阻药物中的应用。上述KctdlO基因剔除小鼠模型在筛选治疗早期胚胎心脏发育缺陷药物中的应用。本发明通过Cre-IoxP系统，构建了确为可靠的KctdlO基因剔除小鼠模型。然后通过组织胚胎学实验，采用多种组织胚胎学及分子生物学手段，发现KctdlO基因剔除会导
3致小鼠胚胎发育滞后，血管生成受阻，心脏发育缺陷，证明该基因的作用。
图1，钾离子通道蛋白KctdlO基因打靶载体示意图。图2，通过基因型鉴定的方法筛选KctdlO基因缺陷型小鼠。图3，通过Wfestern免疫印迹和RT-PCR分析确认KCTDlO蛋白缺失。图4，KctdlO基因缺陷型小鼠在胚胎发育早期发育滞后。图5，KctdlO基因缺陷型小鼠血管发育障碍。图6，KctdlO基因缺陷型小鼠心包膜异常扩大，心肌壁较薄，房室瓣缺失。图7，免疫组化结果显示KctdlO基因在早期胚胎发育中的心脏内皮表达较高。
具体实施例方式实施例一钾离子通道蛋白KctdlO基因敲除动物模型的构建
KctdlO基因的剔除可以利用Cre-IoxP系统来实现，将打靶载体电击转化胚胎干细胞， 使其与基因组发生同源重组。再将阳性胚胎干细胞移植入胚胎，产生在KctdlO基因的两侧带有IoxP位点的后代，将这些后代与表达Cre重组酶的小鼠杂交，产生KctdlO基因剔除小鼠模型。通过基因型鉴定，RT-PCR，免疫印迹等实验，本发明验证了此模型中确实发生了 KctdlO基因的缺失，结果如图1，图2，图3所示。实施例2钾离子通道蛋白KctdlO基因敲除小鼠的表型分析
在实施例1中获得的KctdlO基因缺陷小鼠早期胚胎发育过程中跟踪观察，发现KctdlO 基因缺陷小鼠在早期胚胎发育过程中出现发育滞后现象(图4)、血管发育障碍(图5)、心脏发育缺陷，心外包膜异常扩大，心肌壁相对较薄，房室瓣缺失(图6)，免疫组化结果显示 KctdlO基因在早期胚胎中的心脏内皮中高表达(图7)，显示KctdlO在心脏的早期发育中具有很重要的作用。
权利要求
1.一种与心脏、血管发育密切相关的钾离子通道蛋白KctdlO基因剔除小鼠模型。
2.—种构建根据权利要求1所述的KctdlO基因剔除小鼠模型的方法，其特征在于该方法的具体步骤为利用Cre-LoxP系统，将打靶载体电击转化胚胎干细胞，使其与基因组发生同源重组，再将阳性胚胎干细胞移植入胚胎，产生KctdlO基因的两侧带有LoxP位点的后代，将这些后代与表达Cre重组酶的小鼠杂交，从而获得KctdlO基因剔除小鼠模型。
3.一种根据权利要求1所述的KctdlO基因剔除小鼠模型在筛选促进生长发育的药物中的应用。
4.一种根据权利要求1所述的KctdlO基因剔除小鼠模型在筛选促进血管生成的药物中的应用。
5.一种根据权利要求1所述的KctdlO基因剔除小鼠模型在筛选促进心脏发育的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种与心脏、血管发育密切相关的钾离子通道蛋白Kctd10基因敲除小鼠模型及其应用。通过同源重组和胚胎干细胞移植以及Cre-LoxP系统，得到Kctd10基因剔除小鼠模型，经过研究发现Kctd10基因缺陷小鼠在早期胚胎发育过程中出现发育滞后现象，并出现血管发育障碍、心脏发育缺陷，免疫组化结果显示Kctd10基因在早期胚胎中的心脏内皮中高表达，显示Kctd10在心脏的早期发育中具有很重要的作用。
文档编号A01K67/027GK102492686SQ201110411059
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者任凯群, 向双林, 周建林, 张健, 胡翔 申请人:湖南师范大学