专利名称：一种花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及植物诱导再生技术领域，具体涉及一种花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法。
背景技术：
花烛iAnthurium aflt/raea/w )又名红掌、安祖花,为天南星科花烛属植物,是一种重要的热带观赏植物。在许多热带国家和地区花烛是主要的切花和盆花来源，已发展成为仅次于热带兰的第二大热带花卉商品。目前，花烛种苗生产主要采用器官发生途径，该途径存在愈伤组织诱导周期较长、无菌苗易发生退化与变异等缺点，而体细胞胚胎发生途径则具有体胚数量多、繁殖速度快、遗传稳定等优点，与液体培养方式相结合可为花烛的规模化种苗生产提供有效途径。
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花烛体细胞胚发生和植株再生研究始于20世纪90年代。1992年，Kuehnle等首次通过花烛叶片培养，高频率诱导体细胞胚胎发生并获得完整再生小植株；2006年，辛伟杰等由‘Sonate’品种叶片诱导出可以连续继代增殖的胚性愈伤组织并获得了再生植株；2011年,Fitch等以‘Marian Seefurth’品种叶片诱导获得的胚性愈伤组织,进行遗传转化并获得了转基因植株；2008年，许传营以‘Amigo’品种叶片诱导的胚性愈伤组织为材料进行了液体悬浮培养和植株再生研究，获得的胚性细胞团每月可增殖4飞倍；经过分化培养再生出完整小植株。根据公开资料，现有技术中花烛胚性悬浮培养条件为l/2MS+2，4-D I. Omg/L+KT(TO. 5 mg/L+蔗糖3%，暗培养，继代间隔为25天。胚性细胞悬浮培养系的增殖系数大约是每月4飞倍。花烛胚性悬浮细胞团进行植株再生分为四个阶段(1)将的胚性愈伤组织接种于液体培养基中培养30天，形成盾形胚；(2)将盾形胚接种到液体培养基中培养20天，体胚萌发产生白色透明状胚根；(3)液体条件下进行光照培养20天，胚根变绿并伴有胚芽萌发；(4)将体胚转接于固体培养基中进行萌发成苗，30天后萌发出真叶。整个植株再生过程需要100天。现有技术中胚性细胞悬浮培养系的增殖速度低，植株再生步骤复杂，周期较长。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中胚性细胞悬浮培养系的增殖速度低，植株再生步骤复杂，周期较长的不足，提供一种花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的改良方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现
提供一种花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，包括以下步骤
(a)诱导形成胚性愈伤组织；
(b)建立胚性细胞悬浮培养系，获得直径I.(Γ2. O毫米的胚性细胞团；
(C)利用步骤(b)获得的胚性细胞团再生植株，其中所述建立胚性细胞悬浮培养系包括如下步骤(bl)破碎所述胚性愈伤组织获得直径不超过I. O毫米的胚性细胞团；
(b2)将O. 1 0. 2克的胚性细胞团接种于悬浮培养基中，在温度25 27°C，光照800 1000lux,90^110转/分钟震荡培养，其中所述悬浮培养基以MS培养基为基本培养基，每I升基本培养基中添加2. (Γ3. O毫克的6-ΒΑ、1. (Γ2. O毫克的2，4_D、2(T40克的蔗糖，pH值为5. 6 6. O ；
(b3)6^8天继代一次，继代时将增殖的胚性细胞团破碎，将O. Γ0. 2克的胚性细胞团转移至新鲜的悬浮培养基的中，按相同条件继续培养，3^4周后，胚性细胞大量增殖，获得直径为I. (Γ2. O毫米的胚性细胞团。在优选的实施方式中，所述步骤(a)包括
(al)取花烛的幼嫩苗叶片或茎段，经表面消毒处理，将叶片或茎段切成3 10毫 米的片段，接种于胚性诱导培养基中；
(a2)在温度25 27°C的黑暗环境中培养3飞周，获得黄色的胚性愈伤组织。在优选的实施方式中，所述花烛的品种为阿拉巴马。在优选的实施方式中，所述继代为7天一次。在优选的实施方式中，所述步骤(C)包括
(Cl)将获得的直径I. (Tl. 5毫米的细胞团接种至分化培养基中；
(c2)在温度25 27°C、光照强度为1000 1400 lux，每日10 14小时光照环境中培养6^10周后，形成绿色体细胞胚并进一步发育形成完整小植株。在本发明的实施方式中，所述分化培养基以1/41/20MS培养基为基本培养基，每I升基本培养基添加(TO. 01毫克的6-BA、10克的蔗糖和6、克的琼脂，pH值为5. 6^6. 0，在优选的实施方式中，所述分化培养基以Ι/fl/lOMS培养基为基本培养基，更优选为以1/10MS培养基为基本培养基。在优选的实施方式中，I升基本培养基中添加O. 005毫克的6-BA。本发明的有益效果是本发明通过改变悬浮培养的培养基成分、光照条件和继代间隔，胚性细胞团每周增殖最高可达3. 02倍，每月可增殖83倍，按每月增殖的倍数计算，比以往技术的增殖效率提高了 15倍以上；而且简化了植株再生的操作过程，只需要一个步骤即可完成胚性细胞团的植株再生；同时缩短了植株再生的时间，6 10周完成植株再生，t匕以往技术节约时间20天以上。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明
实施例I
(1)胚性愈伤组织胚性诱导取花烛品种阿拉巴马的幼嫩苗叶片，经表面消毒处理，将叶片切成5毫米的片段，接种于胚性愈伤组织胚性诱导培养基中，在温度26°C的黑暗环境中培养4周，获得黄色的胚性愈伤组织；
(2)胚性细胞悬浮培养系的建立在孔径I.O毫米的金属网中，用镊子将胚性愈伤组织破碎，通过金属网筛成直径不超过I. O毫米的胚性细胞团；将O. I克的胚性细胞团接种于放有20毫升胚性细胞悬浮培养基的100毫升三角瓶中，在温度26°C的，光照900 lux, 100转/分钟震荡培养；继代时用上述方法将增殖的胚性细胞团破碎，将O. I克的胚性细胞团转移至放有20毫升胚性细胞悬浮培养基的100毫升三角瓶中，按上述条件继续培养，每周继代一次。3周后，胚性细胞大量增殖，建立胚性细胞悬浮培养系。其中所述胚性细胞悬浮培养基是以MS培养基为基本培养基，同时还含有3. O mg/L 的 6-BAU. O mg/L 的 2，4_D、30 g/L 的蔗糖，pH 值为 5. 8 ；
(3)植株再生用孔径I. O毫米的金属网筛选直径略大于I. O毫米的胚性悬浮细胞团，转移至分化培养基中，在温度26°C、光照强度为1200 lux，每日12小时光照环境中培养，6^10周后，形成绿色体细胞胚并进一步发育形成完整小植株。其中所述分化培养基为以1/10MS培养基为基本培养基，同时还含有O. 005 mg/L的6-BA、10 g/L的蔗糖和8g/L的琼脂，pH值为5. 9。按上述条件培养，花烛胚性愈伤组织诱导率达96. 5% ;建立的胚性细胞悬浮培养系每周可增殖3. 02倍，每月可增殖83倍；获得的胚性细胞团中，体细胞胚形成率达100% ；体细胞胚的植株再生率达55. 3 %。 实施例2
本实施例与实施例I不同的是取花烛品种‘阿拉巴马’的幼嫩苗茎段，经表面消毒处理，切成10毫米截段，然后接种于体细胞胚诱导培养基中培养获得体细胞胚，其余与实施例I相同。按这种条件培养，花烛胚性愈伤组织诱导率达95. 1%。实施例3
本实施例与实施例I或2不同的是步骤(2)中胚性细胞悬浮培养基中含有2. O mg/L的6-BA、2. O mg/L的2，4_D，其余与实施例I或2相同。按这种条件培养，胚性细胞悬浮培养系每周可增殖2. 82倍，每月可增殖63倍以上。实施例4
本实施例与实施例I或2不同的是步骤(2)中胚性细胞悬浮培养基中含有3. O mg/L的6-BA、2. O mg/L的2，4_D，其余与实施例I或2相同。按这种条件培养，胚性细胞悬浮培养系每周可增殖2. 94倍，每月可增殖73倍以上。实施例5
本实施例与实施例I或2不同的是步骤(3)中分化培养基以1/4MS培养基为基本培养基；其余与实施例I或2相同。按这种条件培养，体细胞胚形成率达50. 62% ;体细胞胚的植株再生率达33. 92 %。实施例6
本实施例与实施例I或2不同的是步骤(3)中分化培养基以1/12 MS培养基为基本培养基；其余与实施例I或2相同。按这种条件培养，体细胞胚形成率达91. 55% ;体细胞胚的植株再生率达41. 65%。表I和表2总结了不同浓度激素配比情况下胚性细胞增殖培养阶段每周增殖倍数和每月增殖倍数的变化，以及以不同浓度稀释的MS培养基作为基本培养基时体细胞胚形成率和植株再生率的变化情况。
权利要求
1.一种花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，包括如下步骤 Ca)诱导形成胚性愈伤组织； (b)建立胚性细胞悬浮培养系，获得直径I. (Γ2. O毫米的胚性细胞团； (C)利用步骤(b)获得的胚性细胞团再生植株，其中所述建立胚性细胞悬浮培养系包括如下步骤 (bl)破碎所述胚性愈伤组织获得直径不超过I. O毫米的胚性细胞团； (b2)将O. 1 0. 2克的胚性细胞团接种于悬浮培养基中，在温度25 27°C，光照800 1000lux,90^110转/分钟震荡培养，其中所述悬浮培养基以MS培养基为基本培养基，每I升基本培养基中添加2. (Γ3. O毫克的6-ΒΑ、1. (Γ2. O毫克的2，4_D、2(T40克的蔗糖，pH值为5. 6 6. O ； (b3)6^8天继代一次，继代时将增殖的胚性细胞团破碎，将O. Γ0. 2克的胚性细胞团转移至新鲜的悬浮培养基的中，按相同条件继续培养，3 4周后，获得大量胚性细胞团。
2.如权利要求I所述的花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，所述步骤(a)包括 (al)取花烛的幼嫩苗叶片或茎段，经表面消毒处理，将叶片或茎段切成3 10毫米的片段，接种于胚性诱导培养基中； (a2)在温度25 27°C的黑暗环境中培养3飞周，获得黄色的胚性愈伤组织。
3.如权利要求2所述的花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，其中步骤(al)的花烛的品种为阿拉巴马。
4.如权利要求I所述的花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，其中步骤(b3)中所述继代为7天一次。
5.如权利要求I所述的花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，其中所述步骤(c)包括 (Cl)将获得的直径I. (Γ2. O毫米的细胞团接种至分化培养基中； (c2)在温度25 27°C、光照强度为1000 1400 lux，每日10 14小时光照环境中培养6^10周后，形成绿色体细胞胚并进一步发育形成完整小植株。
6.如权利要求5所述的花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，其中所述分化培养基以1/41/20MS培养基为基本培养基，每I升基本培养基添加(TO. 01毫克的6-BA、10克的蔗糖和6、克的琼脂，pH值为5. 6^6. O。
7.如权利要求5所述的花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，其中所述分化培养基以1/8 1/12MS培养基为基本培养基。
8.如权利要求5所述的花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，其中所述分化培养基以1/10MS培养基为基本培养基。
9.如权利要求5所述的花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，其中每I升基本培养基添加O. ΟΟΓΟ. 01毫克的6-ΒΑ。
10.如权利要求5所述的花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法，其中每I升基本培养基添加0. 005毫克的6-ΒΑ。
全文摘要
本发明公开了一种花烛胚性细胞快速增殖并再生植株的方法。本发明通过改变现有技术中悬浮培养的培养基成分、光照条件和继代间隔，使胚性细胞团每周可增殖2.82~3.02倍，每月增殖最高可达83倍，比以往技术的增殖效率提高了15倍以上，而且简化了植株再生的操作过程，只需要一个步骤即可完成胚性细胞团的植株再生；同时缩短了植株再生的时间，6~10周完成植株再生，比以往技术节约时间20天以上。
文档编号A01H4/00GK102893868SQ201210396990
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月18日 优先权日2012年10月18日
发明者于波, 廖飞雄, 刘金梅, 刘晓荣, 朱根发, 操君喜, 李伟峰 申请人:广东省农业科学院花卉研究所