一种铜绿假单胞菌株的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物农药【技术领域】，特别涉及拮抗菌-铜绿假单胞菌（Pseudomonas?aeruginosa）SU8，已于2013年5月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?NO：M2013178。该菌株SU8发酵液的乙酸乙酯提取物与井冈霉素复配后对防治水稻纹枯病菌具有增效作用；且该提取物对水稻细菌性条斑病菌和柑橘溃疡病菌具有抑制作用。
【专利说明】一种铜绿假单胞菌株的应用
[0001]本申请是申请号为201310250195.0、申请日为2013年6月21日，发明名称为一种铜绿假单胞菌株的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明属于生物农药【技术领域】,特别涉及拮抗菌-铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) SU8,同时还涉及该菌株的应用。
【背景技术】
[0003]在农业生产上，常使用化学农药防治作物病害的发生。尽管化学农药对作物病害有理想的防治效果，但由化学农药带来的负面问题日益突出，譬如:污染环境、破坏天敌，长期使用也易诱发病原菌产生抗药性。其次，过量的施用化学农药不仅增加了用药成本，也会导致农药残留。依靠现代生物防治技术，采用拮抗菌防治作物病害的发生起着非常重要的作用，特别是利用拮抗菌产生的活性物质防治作物病害，具有安全、高效、低毒、无污染、周期短、易于研究、便于生产、无残留等优点。
[0004]早期的研究结果表明:假单胞菌作为一种拮抗菌具有较大的开发潜力。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)又是假单胞菌的一种,可产生吩嗪_1_羧酸、藤黄绿脓菌素、2，4_ 二乙酰藤黄酚等多种活性物质，对水稻纹枯病、稻瘟病、烟草黑胫病、油菜菌核病、杂交竹梢枯病等多种植物病原菌具有抑制作用。由于该菌可产生多种抑菌物质，不同菌株产生的抑菌物质不一样，同一菌株也可产生多种抑菌物质,而且这些抑菌物质对植物病原真菌具有抑制作用，但其提取物与井网霉素的复配物对植物病原真菌抑制作用鲜见研究，而且对植物病原细菌的研究较少，仅见其代谢产物绿脓菌素对细菌具有抑制作用，其他代谢产物对植物病原细菌的研究也未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) SU8。
[0006]本发明所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) SU8,已于2013年5月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M2013178。
[0007]本发明菌株SU8的特性:
[0008]1.形态特征
[0009]在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在温度28_30°C连续培养30h，通过电显微镜扫描观察，菌株SU8 呈长杆状，菌体长短均匀，一般长度在1-1.5 μ m范围内，有时成对或短链状排列，见图1。革兰氏染色后的菌体呈红色，指示该菌株为革兰氏阴性菌。
[0010]2.在各种培养基上生长(温度28_30°C，培养30h)的特征
[0011]马铃薯葡萄糖培养基:菌落呈山脉状、湿润、表面粗糙边缘光滑、呈淡黄色无金属光泽、长时间培养产生墨绿色积淀物、紫外灯下有荧光。可溶性色素有。
[0012]牛肉膏蛋白胨培养基:菌落呈圆形、湿润、表面粗糙有小点状突起、早期呈黄绿色、后期呈红褐色、紫外灯下无荧光。可溶性色素有。
[0013]高氏一号培养基:菌落呈圆形、湿润、表面与边缘均光滑、无色透明状。可溶性色素无。
[0014]King氏培养基:菌落呈山脉状、湿润、表面粗糙有小点状突起、边缘光滑、有铜绿色金属光泽，紫外灯下有荧光。可溶性色素有。
[0015]3.生理化特征
[0016]能利用D-木糖、D-葡萄糖、甘露糖、赤藓糖、阿糖醇、松三糖、甘油、柠檬酸盐、甲基红，可使明胶液化、脂肪分解、硝酸盐还原、氧化酶阳性、脓青素阳性、接触酶阳性、过氧化氢酶阳性、鸟氨酸脱羧酶阳性，但不能利用乳糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、肌醇、半乳糖、D果糖、蔗糖、棉籽糖、石蕊牛乳、糊精、麦芽糖、山梨酸糖、水杨苷、七叶灵、不产生硫化氢、氨气、吲哚等，属于好氧菌，能在41°C下生长但不能再4°C下生长。
[0017]参照文献《常见细菌系统鉴定手册》，结合本菌株SU8在各种培养基上的培养性状和生理生化特征，显示该菌株符合铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的相关鉴定特征。将菌株SU816S rDNA的PCR扩增产物进行测序，序列经BLAST比对显示，与铜绿假单胞菌菌株P.aeruginosa SRDchr3 (EU714901)序列的同源性达到99%。通过系统进化树构建,显示本菌株SU8与铜绿假单胞模式菌株 P.aeruginosa ATCC10145聚在同一系统进化分支(见图2)，同源性达到99%。结合本菌株SU8序列分析、形态特征、培养特征、生理化特征，与《常见细菌系统鉴定手册》判断该菌株属于铜绿假单胞菌属(P.aeruginosa),并命名为铜绿假单胞菌(P.aeruginosa) SU8。
[0018]将本发明菌株SU8按8-12%接种量接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，磁力搅拌子转速为100-120r/min，置28-30°C振荡培养箱中连续发酵培养72-96h，可获得发酵液。最佳发酵条件为:接种量10%，转速115r/min，温度为29°C，时间85h。
[0019]本发明菌株SU8的发酵液经乙酸乙酯萃取并经浓缩后，得到乙酸乙酯提取物，该提取物与井R霉素复配后，对水稻纹枯病菌具有增效作用，并对水稻细菌性条斑病菌和柑橘溃疡病菌等植物病原细菌具有抑制作用，为进一步研制新农药提供了理论依据，为控制植物病害提供理论基础。
[0020]与现有技术相比，本发明具有的优点为:
[0021]1、发酵工艺简单、快捷、操作方法方便。
[0022]2、本发明分离获得的提取物与井R霉素的复配物对防治水稻纹枯病菌具有增效作用。
[0023]3、本发明分离获得提取物对水稻细菌性条斑病菌和柑橘溃疡病菌具有抑制作用，扩大了抑菌谱。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明菌株SU8的电镜扫描图。
[0025]图2是本发明菌株SU8的系统发育树。
[0026]图3是本发明菌株的乙酸乙酯提取物对水稻细菌性条斑病菌抑制作用图。其中:I表示乙酸乙酯提取物，2表示乙酸乙酯溶剂。
[0027]图4是本发明菌株发酵液的乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌抑制作用图。其中:I表示乙酸乙酯提取物，2表示乙酸乙酯溶剂。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体试验和实施例对本发明的技术方案作进一步说明，本发明试验和实施例中涉及的百分比均为质量百分比。
[0029]以下实施例中用到的水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonoasoryzaepv.0ryzicola)、相橘溃瘍病菌(Xanthomonas Campestrispv.citri )由湖南农业大学植物病理学实验室提供。
[0030]实施例1本发明菌株的制备
[0031]采用稀释分离法从浏阳市的稻鸭共养田中筛选拮抗菌。准确称取IOg鸭粪放入90mL带玻璃珠的无菌水中，振荡30min，静置IOmin后取悬浮液，按梯度浓度法稀释至IX 10_7倍，然后将稀释液涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上培养，得到单个菌落。将获得的单个菌落用无菌水制成悬浮液并做成滤纸片，存放在距中央水稻纹枯病菌菌饼(5_)两侧对称2cm处的马铃 薯琼脂培养基平板上培养，指示菌菌落长满平板后，挑取有抑菌圈的细菌菌落，反复纯化，获得单一菌落，即为本发明的铜绿假单胞菌SU8。
[0032]实例2本发明菌株的活化和发酵
[0033]采用接种环将本发明菌株SU8接入牛肉膏蛋白胨斜面培养基(牛肉膏3_6g、蛋白胨 8-10g、氯化钠 4-5g、葡萄糖 15-20g，水 1000mL, pH 为 7.2-7.3)，28°C下培养 24h。再按10%接种量接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，磁力搅拌子转速为1000r/min，置28-30°C振荡培养箱中连续培养84h，获得发酵液。
[0034]实例3抑菌物质的提取
[0035]取发酵液和乙酸乙酯以1:2的比例充分混匀浸溃萃取48h，将萃取液置入旋转蒸发仪在温度40°C,转速110r/min旋转蒸发至膏状,获得抑菌物质。
[0036]实例4拮抗活性检测
[0037]拮抗真菌的测定方法:将柑橘溃疡病菌接种于PDA固体培养基中央，28°C下培养24h后在新长成的菌丝两侧打孔(Φ=5πιπι)，将待测活性物质(实施例3中提及的抑菌提取物)注入一孔内，另一侧孔内注入相应的溶剂，每孔50 μ L，并以相应的溶剂作空白对照，28°C培养24-48h，观察抑菌状况及抑菌圈大小，每个处理3次重复。
[0038]拮抗细菌的测定方法:采用平皿打孔法，将水稻细菌性条斑病菌悬浮液(I X 108cfu/mL) 60 μ L均匀涂布于NA平板，然后打孔(Φ =5mm),将待测活性物质(实施例3中提及的抑菌提取物)注入一孔内，另一侧孔内注入相应的溶剂，每孔50 μ L，并以相应的溶剂作对照，28°C培养24-48h，观察抑菌状况及抑菌圈大小，每个处理3次重复。
[0039]结果表明:该乙酸乙酯提取物对水稻细菌性条斑病菌和柑橘溃疡病菌具有抑制活性，而对照溶剂无抑制活性，见图3及图4。
[0040]实例5乙酸乙酯提取物与井R霉素复配物对水稻纹枯病菌的毒力测定
[0041]经预试确定各药剂有效浓度范围，每个药剂按有效成分含量分别设5个剂量处理，设相应的溶剂为对照(水:乙酸乙酯:丙酮)。参照《农药室内生物测定试验准则杀菌剂》进行，采用菌丝生长速率法测定药剂对靶标病菌的毒力。培养72h用十字交叉法测量菌落直径，计算各处理菌丝生长抑制率，得出EC50和毒力回归方程等参数，同时根据Wadley法计算两药剂不同配比联合增效比值(SR)，SR〈0.5为拮抗作用，0.5≤SR≤1.5为协同作用，SR>1.5为增效作用。
[0042]试验结果表明:对照对水稻纹枯病菌无影响，而复配物对水稻纹枯病菌的室内毒力测定结果为乙酸乙酯提取物和井冈霉素的EC5tl分别为4120.17 μ g/mL和404.81 μ g/mL,乙酸乙酯提取物的毒力仅为井R霉素0.1倍，说明乙酸乙酯提取物的毒力低于井R霉素；将乙酸乙酯提取物与井网霉素经复配后在1-10和10-1范围内具有协同和增效作用，其中乙酸乙酯提取物和井R霉素按9:1增效最明显，其他配比1:9、1:1、4:1也有增效作用，而1:4配比则有协同作用，见下表1。
[0043]表1乙酸乙酯提取物、井冈霉素及其复配物对水稻纹枯病菌的毒力测定
[0044]
【权利要求】
1.一种保藏号为 CCTCC N0.M2013178 的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SU8菌株在抑制柑橘溃疡病菌 中的应用。
【文档编号】A01P1/00GK103704274SQ201410019910
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年6月21日 优先权日:2013年6月21日
【发明者】廖晓兰, 张亚, 苏品, 黄璜, 刘双清 申请人:湖南农业大学