用来确认酶活性的细胞对照的制作方法

专利名称：用来确认酶活性的细胞对照的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种参比细胞对照，该对照自血液细胞制成，可用于使用电子和/或光学方法的设备中以确认酶活性；且涉及制备和使用该细胞对照的方法。
背景技术：
细胞酶学研究细胞中酶的功能。在历史上，使用细胞溶胶研究细胞中酶的活性。但是，已经研制出来新的试剂以用于在代谢活泼的完整细胞中研究酶活性。这些新的试剂使得细胞酶学发展到了一个新的阶段，使得通过显微镜和流式细胞仪的细胞学检查，功能性细胞测定就能够诊断疾病和监测这种疾病的治疗过程。这些已经研制出来的新试剂是人工合成的荧光底物试剂，其能够在细胞结构内部检测酶活性。这些荧光底物试剂的实例是由位于佛罗里达州迈阿密的Coutler公司出售的CellProbeTM试剂。这些新试剂的详细说明可见共同未决的美国专利申请08/443,776号。
在测定特定的细胞酶活性时，为了确定荧光底物试剂的效能必须根据一种独立的生物对照物质来建立该试剂的效能。这些生物对照物质(又被称作细胞对照)，对于确定临床测定和细胞酶学测定的精确性和准确性十分重要。而为保证检测结果和方法的可靠性、准确性及保证其在不同时间和不同实验室间的重复性，都需要细胞对照。另外，一些指导这些检测的州或联邦政府的法规也常常需要一种细胞对照来证实这些仪器运转正常。细胞对照应该稳定，并且在性质上应与所研究的样品相类似。
美国专利5,059,518号公开了一种细胞对照，Coulter公司生产的CYTO-TROL，其由在含海藻糖的高渗性溶液中冻干的正常人细胞组成。该细胞用作流式细胞仪中的抗原对照。该试剂用酶抑制剂来抑制水解酶的活性。该产品由耗贫的白细胞制剂所制备，其中淋巴细胞是仅存的白细胞。但是，该产品并不保留正常人细胞特征的酶活性。
发明概述本发明涉及一种用于使用电子和/或光学方法的仪器中的酶细胞对照。该发明还涉及一种细胞对照，其是来自完全细胞的稳定冻干物质，具有类似人白细胞的所选酶的胞内活性。
本发明提供了一种新型的细胞对照产品，其包括一种冻干的哺乳动物细胞，该细胞能够重新溶解(rehydrate)于水中以显示细胞结构和细胞酶活性，因而在酶分析中，所述的冻干细胞能够有效地作为细胞酶学细胞对照，其中所述的细胞结构能够通过光散射分析或显微镜分析来鉴定，所述细胞酶活性能够通过荧光分析来鉴定。该冻干的细胞对照具有真正的时间稳定性，其在2-8℃之间至少可以保存2个月。
使用细胞酶学细胞对照的方法包括将冻干的哺乳动物细胞重新溶解于水中。该冻干细胞能够被重新溶解于水中以显示细胞结构和细胞的酶活性，因而在酶分析中，所述的冻干细胞能够有效地作为细胞酶学细胞对照。所述的细胞结构能够通过光散射分析或显微镜分析来鉴定，而所述细胞酶活性能够通过荧光分析来鉴定；将所述细胞对照放置于能够检测荧光强度的仪器中；分析所述细胞对照的荧光强度。
制备细胞酶学对照细胞的方法包括收集悬浮在一定体积生理可接受的缓冲液中的预先测定数量之异常哺乳动物细胞；离心此细胞悬浮液获得细胞沉淀；向细胞沉淀中加入一种碳水化合物溶液以形成可冻干的细胞悬浮液；将此可冻干的细胞悬浮液移至一容器内；并冻干此细胞悬液。更优选地，该异常哺乳动物细胞选自Molt4、CEM和HL60细胞系。
附图简述


图1、图2和图3代表所述发明的细胞对照、CYTO-TROL，和人淋巴细胞分别与荧光底物反应的直方图。
发明详述可以用特定术语来解释本发明及
图1至图3中的直方图所示的比较实验结果。这里使用的术语定义如下1．“背景荧光”是指样品中除所研究的细胞特异荧光外任何物质发射的荧光。
2．“自身荧光”是背景荧光的一种，其中细胞发射的荧光是由非荧光物质，例如染料，诱导发射的。
3．“非特异荧光”是指这种现象，即一种荧光化合物不是通过在细胞壁中所含的同类酶中的一种或多种激活，而是由其它的方式被激活、4．“光散射”是指流式细胞仪中发生的现象，其当一束偶然光，例如一束激光，冲击一个细胞而引发。其中一些光被多方向反射而另一些则穿透细胞。散射的光线，包括反射的角度及由于细胞内所含荧光物质产生的荧光可以被检测到，并用来确定细胞的特性，例如细胞的大小或体积，细胞的表面平滑度和颗粒数量及细胞的其他特性。那些特性与正常细胞有可比性。
5．“平均通道(MC)”表示所分析细胞的平均相对荧光量。
6．“阳性百分比”表示所分析的细胞中荧光高于背景荧光的细胞百分比。
7．“异常细胞样本”是指内部酶活性不同于正常血液细胞样本的细胞样本，或具有在正常血液细胞样本不存在的酶活性的细胞样本。
一般而言，制备一种细胞酶学细胞对照的方法取决于细胞样本的选择，该样本在制备后应具有特定的酶活性。细胞样本可由富含白细胞的抗凝固血液或由特定类型的培养细胞制备。优选的，细胞样品包括细胞内具有与正常血液细胞样本不同酶活性的异常细胞样本，或是存在正常血液细胞样品中不存在的酶活性的异常细胞样本。
第一种情况，通过裂解白细胞样本中的红细胞，并通过清洗去除细胞裂解碎片而制备白细胞样本。或者，红细胞也可使用其它合适的方法去除，例如利用沉降技术或使用偶联于一种不溶性底物的红细胞特异性抗体。如果需要，血液样本中特定类型的非红细胞细胞也可使用偶联于不溶性支持物的附加的选择性抗体去除。例如特异于粒细胞上特有抗原的单克隆抗体可以与一种不溶支持物相结合，所得偶联抗体可用来去除不含红细胞的血液样本中的粒细胞。具磁性或不具磁性的玻璃珠，陶珠或多聚高分子珠均属于可用的支持物。或者，特定的细胞还可使用众所周知的密度梯度技术来去除。
第二种情况，异常细胞样本也可通过前述方法制备，只是应从异常血液样本开始。另外，异常细胞样本还可通过移去细胞样本中特定的细胞来制备。这些移走的或样本中剩下的细胞均可使用本领域已知技术方法加以修饰转化为异常细胞样本。例如，一些转化的方法包括美国专利5,443,986公开的Haughland等的方法，使用本领域熟练技术人员已知的方法用反转录病毒和一种酶来转化细胞。
还有，异常细胞样本可以是从人类异常白细胞中建立的选定的细胞系，这些细胞可用来制备根据本发明的细胞对照。选定的细胞系用已经建立的方法在组织培养液中培养，收集细胞，如有需要，可使用医学或酶学方法对细胞进行进一步处理以保留细胞酶成分。例如已经发现Molt4,HL60和CEM细胞内具有本发明所需的内源异常酶活性。这些细胞系可从位于马里兰州，Rockville的美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。
如此获得的细胞样品可以按照合适的保存技术保存，以用作酶的细胞对照。通常细胞需要漂洗以除去血清胞质生长培养液和多余的细胞酶。在一批样本产物中，1000ml含1×106个细胞/毫升的样本在约2-8℃,200G重力条件下离心约10分钟以收集细胞。细胞沉淀重悬在pH值约5-9，优选是6-8的生理缓冲液中，例如Hanks缓冲液或磷酸盐缓冲液中，浓度约为20×106个细胞/毫升。然后重悬细胞再次于约2-8℃,200G重力条件下离心约10分钟。弃去上清，细胞沉淀重悬于pH值约为5-9,优选是6-8的生理缓冲液中。细胞重悬液第三次于约2-8℃,200G重力条件下离心约10分钟，细胞沉淀也于2-8℃第三次重悬于pH值约从5-9，优选是6-8的生理缓冲液中，得到细胞悬浮液，浓度为约15×106个细胞/毫升。在另一容器中，一种碳水化合物载体，例如分子量约为100,000至200,000,优选是125,000至175,000的葡聚糖溶解于pH值约5-9,优选是6-8的生理缓冲液中，得到载体溶液，浓度约为每100ml溶液中含葡聚糖约5-10克，优选是7-8克。
下一步，取80ml载体溶液置于冰浴中的容器内，加入磁搅拌子。向该载体溶液中加入20ml细胞悬浮液，其中应含有约200-400×106个细胞，优选是250-350×106个细胞。搅拌约10分钟形成可冻干的细胞混合液。接着，将约750μl可冻干的细胞混合液加入一小瓶中，并用开裂的橡皮塞部分塞上。然后，运用本领域熟练技术人员共知的方法将可冻干的细胞混合液冻干。冻干循环结束后，将小管从冻干仪中取出，于2-8℃储存。对冻干的对照细胞进行试验以检验其质量。
重构时，向每个小管中加入约750微升蒸馏水或去离子水。重构的细胞对照的pH值约为5-9,优选是6-8。为在流式细胞仪中进行细胞对照测定时，根据实际生产厂家的说明方法，将重构的细胞对照与荧光底物相结合，然后，由流式细胞仪或荧光显微镜的方法对其进行分析。另外，该细胞对照也可用于其它酶测定或其它合适的诊断用酶学方法中。
细胞对照、制备细胞对照的方法和使用此细胞对照的方法可以通过以下一些实施例更好地加以理解。但是，敬请理解，本发明并不仅仅局限于所描述的实施例，并且，其它制备和使用根据本发明的对照细胞的方法也能适用。实施例1制备细胞酶学细胞对照的方法材料1．Hanks缓冲液1X,pH7.4至7.55,275至295毫渗压单位(mOsm)。
2．CEM细胞15×106个细胞/毫升，溶于pH7.5的Hanks缓冲液中。
3．葡聚糖试剂级，分子量150,000,购自Solon,Ohio的Amresco。
4．除去内毒素的蒸馏水。
5．2ml大小的玻璃螺口小瓶，开裂橡皮塞，螺旋盖。
6．细胞计数器，Coulter公司型号ZB1，或等效物。
7．pH计，渗透压计，磁搅拌子，带0.2微米滤膜的过滤装置。
8．真空烧瓶装置，冷冻离心机，离心瓶。
9．RPMI培养基，显微镜，载玻片，含5％CO2的37℃培养箱，台盼蓝。
10．无菌的玻璃器皿，烧杯，烧瓶，量筒。方法1．Hanks缓冲液的制备将100ml 10倍的Hanks贮存液(GIBCO,Gaithersburg,Md.Cat.#14185-029)加入至1升Erlenmeyer烧瓶中，加入900ml试剂级蒸馏水(GIBCO,Gaithersburg,Md.Cat.#15230-147)。用磁搅拌子搅拌均匀，并调pH值到范围从7.4至7.55。如需要，可用0.1N的HCl或NAOH调节。用渗透压计测渗透压，渗透压应在275至295之间。用0.2微米滤膜过滤，贮存于2-8℃的冰箱中。
2．CEM细胞的培养CEM细胞在含90％RPMI1640培养液和10％胎牛血清的培养液中培养扩增。每2至3天传代培养一次以维持培养物。使用台盼蓝在显微镜下进行细胞计数和活性检测。种子密度为每毫升0.2至0.25×106个细胞的培养物，倍增时间约24小时。最大培养浓度优选是每毫升1.0×106个细胞，因为大于这个浓度的细胞培养物存活率低，并且细胞的完整性不太好。
3．葡聚糖溶液为制备1升葡聚糖溶液，向一个Erlenmeyer烧瓶中加入900ml Hanks缓冲液及磁搅拌子。向该缓冲液中缓缓加入75克葡聚糖，并持续搅拌。待完全溶解后，转移到1升的量筒中，加入Hanks缓冲液，将总体积调整到1升，并充分混匀。用0.2微米滤膜过滤该葡聚糖溶液至无菌的容器内，贮存于2-8℃。
4．CEM细胞漂洗将第2步得到的培养液中的CEM细胞转移到无菌的500ml离心瓶中，并在约6℃,200G重力条件下离心约12分钟。倒去上清，将每个500ml离心瓶的细胞沉淀转移至无菌的50ml塑料螺口离心管内。用冷的Hanks缓冲液漂洗两次，每次洗后均在约6℃,200G重力条件下离心约10分钟。收集沉淀于50ml离心管内，加入约20ml Hanks缓冲液，缓慢混匀。然后用Coulter ZB-1或其它细胞分析器计数细胞。调整细胞浓度至15×106个细胞/毫升。
5．细胞溶于葡聚糖溶液的CEM将500ml无菌的塑料瓶中(带有磁搅拌子)，置于磁搅拌器上的冰浴内。加入400ml第3步得到的葡聚糖溶液，并开始搅拌。以小流量缓缓加入100ml第4步得到的CEM细胞(应大约含有15×106个细胞/毫升)，搅拌速度要非常慢。加完CEM细胞悬液后继续搅拌约10分钟。
6．冻干将第5步得到的CEM细胞悬液分装倒入冷的冻干盘内的2ml小管内，每管750微升。用开裂橡皮塞部分塞上，并按照以下程序冻干步骤 温度℃ 真空度 时间(分钟)(mm Torr)1 -40 100 6602 -15 100 4203 10 100 4204 25 100 420后加热25 100 107．加盖和标记封塞的小管加盖后进行标记。小管贮存于2-8℃。并进行性能实验。
细胞对照已成功的用于流式细胞仪和显微镜方法的细胞酶学检查。细胞对照的功能是在细胞活性的测量中，校验试剂的效能。细胞对照在重构8小时后仍然稳定。细胞对照最初是设计与Coulter公司出售的CellProbeTM试剂共同使用，以测量流式细胞仪中的细胞酶。买施例2使用细胞酶学细胞对照的方法1．将一管含如实施例1中制备的冻干细胞酶学细胞对照重构于750μl试剂级的蒸馏水中。将细胞置于2-8℃下冷却大约15分钟达到平衡。缓慢混匀后，将50μl重新溶解的细胞对照混合物转移至12×75毫米的玻璃管中。
2．玻璃管置于37℃水浴中孵育约5分钟。
3．向含有细胞对照的反应管中加入25μl新溶解的CellProbeTM试剂，缓慢混合，并在生产厂家所规定的时间内在37℃孵育。
4．置反应管于冰浴中，静置至少3分钟。
5．向反应管中加入1ml冰冷的Hanks或PBS缓冲液，然后在一适当的流式细胞仪中测量荧光。
图1、图2和图3分别显示运用CellProbeTM试剂(Gly-Phe-Gly-Ala)2Rho 110.2TFA时，一个病人的全血细胞样本、本发明的对照细胞和CYTO-TROL的前向散射(FS)对侧向散射(SS)的直方图。这些直方图表明细胞对照具有与获自新鲜的全血样本中的人淋巴细胞可比的形态特性。更特别地，
图1显示了利用用于监测水解酶的CellProbeTM试剂的FS、SS和荧光强度的全血散射图谱。图2显示出利用用于监测
图1全血样本中相同水解酶的CellProbeTM试剂FS、SS和荧光强度的本发明的细胞对照。图3显示的是利用用于监测
图1和图2中相同水解酶的CellProbeTM试剂的FS、SS和荧光强度的CYTO-TROL样本图谱。每次分析中仪器设定的PMT、高压及接收装置的FS、SS和荧光测量均相同。
下表表示的是在同一次检测中运用12种CellProbeTM试剂与本发明的细胞对照和CYTO-TROL产品一起测量水解酶而获取的平均通道值。每一种CellProbeTM试剂均按照实施例1的步骤进行。
其中运用了以下简写Ala---丙氨酸Leu---亮氨酸Gly---甘氨酸Phe---苯丙氨酸Pro---脯氨酸Rho110---罗丹明110TFA---三氟乙酸NaF---氟化钠Z---苄氧碳酰实施例3使用细胞酶学细胞对照的方法1．根据实施例2中步骤1、2、3、4和5描述的方法，将冻干的细胞酶学细胞对照重构，平衡并与CellProbeTM试剂反应。
2．自步骤5中的反应管于室温200G重力条件下离心5分钟。
3．移去上清。
4．一滴(约50微升)的剩余细胞悬浮液均匀涂于盖玻片上，并置于荧光显微镜下检查。
载玻片的显微镜照片显示了细胞结构和细胞内由于细胞酶水解CellProbeTM试剂而引发的荧光。
本申请中提及的所有专利和公开文本此处全部引入作为参考。
在先前的说明书中，为了说明本发明的目的进行了详细描述，这里给出的许多改变均可由熟练技术人员完成而没有背离本发明的精神和范围。
本发明描述的是优选的实施方案。敬请理解本发明并不是仅仅局限于此。本发明的应用范围应指下面的权利要求，而非先前的说明书。
权利要求
1．一种细胞酶学细胞对照，其包括一种冻干的哺乳动物细胞，该细胞能够重新溶解于水中以显示细胞结构和细胞酶活性，因而在细胞酶学分析中所述的冻干细胞能够有效地作为细胞酶学细胞对照，所述的细胞结构能够通过光散射或显微镜的分析来鉴定，所述细胞酶活性能够通过荧光分析来鉴定。
2．权利要求1中的细胞酶学对照细胞，其中，在细胞的自身荧光和背景荧光大致相同时，所述哺乳动物细胞的一种细胞酶活性的荧光平均通道值大于2。
3．权利要求1中的细胞酶学对照细胞，其中，所述哺乳动物细胞的一种细胞酶活性的荧光平均通道值至少是人淋巴细胞荧光平均通道值的50％。
4．权利要求3中的细胞酶学对照细胞，其中，所述哺乳动物细胞的一种细胞酶活性的荧光平均通道值至少是人淋巴细胞荧光平均通道值的100％。
5．权利要求1中的细胞酶学对照细胞，其中，所述哺乳动物细胞包括一种异常哺乳动物细胞。
6．权利要求5中的细胞酶学对照细胞，其中，所述异常哺乳动物细胞选自Molt4、CEM和HL60细胞系。
7．权利要求1中的细胞酶学对照细胞，其中，所述细胞酶活性是一种水解酶活性。
8．权利要求7中的细胞酶学对照细胞，其中，所述细胞酶活性由流式细胞仪中的荧光来鉴定。
9．权利要求8中的细胞酶学对照细胞，其中，所述冻干哺乳动物细胞当重新溶解于水中时pH值从5-9。
10．权利要求7中的细胞酶学对照细胞，其中，所述细胞酶活性由流式细胞仪中的荧光来鉴定，所述的荧光在最低450纳米处被激发。
11．一种使用细胞酶学对照细胞的方法，其包括a)将冻干的哺乳动物细胞重新溶解于水中，该细胞能够重新溶解于水中，以显示细胞结构和细胞酶活性，因而在流式细胞分析中所述的冻干细胞能够有效地作为细胞酶学对照。所述的细胞结构能够通过流式细胞光散射分析来鉴定，所述细胞酶活性能够通过荧光分析来鉴定，b)将该重新溶解的细胞置于一种能检测荧光和细胞结构的仪器中，c)分析所述细胞的荧光。
12．权利要求11中的方法，其还包括将一种血液细胞样本与所述重新溶解于水中的细胞混合。
13．权利要求12中的方法，其中，在细胞的自身荧光和背景荧光大致相同时，所述哺乳动物细胞的一种细胞酶活性的荧光平均通道值大于2。
14．权利要求12中的方法，其中，所述哺乳动物细胞的一种细胞酶活性的荧光平均通道值至少是人淋巴细胞荧光平均通道值的50％。
15．权利要求14中的方法，其中，所述哺乳动物细胞的一种细胞酶活性的荧光平均通道值至少是人淋巴细胞荧光平均通道值的100％。
16．权利要求12中的方法，其中，所述哺乳动物细胞包括一种异常哺乳动物细胞。
17．权利要求16中的方法，其中，所述异常哺乳动物细胞选自Molt4、CEM和HL60细胞。
18．权利要求12中的方法，其中，所述细胞酶活性是一种水解酶活性。
19．权利要求18中的方法，其中，所述重新溶解的细胞在流式细胞仪中分析。
20．权利要求19中的方法，其中，所述重新溶解的细胞pH值从5-9。
21．一种制备细胞酶学对照细胞的方法，其包括a)制备一种在一定体积生理可接受的缓冲液中悬浮的预先确定数量的异常哺乳动物细胞的细胞悬浮液，b)离心所述的细胞悬浮液以得到所述异常哺乳动物细胞的细胞沉淀，c)将细胞沉淀加入一种碳水化合物溶液以形成可冻干的细胞悬浮液，且d)冻干所述可冻干的细胞悬浮液。
22．权利要求21中的方法，其中，所述异常哺乳动物细胞选自Molt4、CEM和HL60细胞系。
全文摘要
提供了一种新型的细胞对照产品,其在利用电子和/或光学方法的设备中通过细胞酶学测定用于确认酶活性。该细胞对照产品包括一种冻干的哺乳动物细胞,该细胞能够重新溶解于水中以显示细胞结构和细胞酶活性,因而在酶分析中所述的冻干细胞能够有效地作为细胞酶学细胞对照。所述细胞对照的细胞结构能够通过光散射分析或显微镜分析来鉴定,细胞酶活性能够通过荧光分析来鉴定。细胞对照具有真正的时间稳定性,在2－8℃之间至少可以保存2个月。优选地,哺乳动物细胞是选自Molt4、CEM和HL60细胞系的异常细胞。
文档编号A01N1/02GK1235510SQ97199332
公开日1999年11月17日 申请日期1997年10月1日 优先权日1996年10月29日
发明者R·S·舒克拉, H·R·克里斯, A·加利奥吉, E·兰德姆, F·J·鲁卡斯 申请人:库特国际公司