具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列的制作方法

专利名称：具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
人基因组学研究目前是国际上的热点，除人染色体DNA大规模测序，表达序列测序(EST)的方法外，还缺少从功能开始的筛选具有功能基因的高通量的方法。
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤，目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此，本领域迫切需要开发研究具有抑癌功能的人蛋白及其激动剂/抑制剂。
本发明的目的是提供一类新的具有抑癌功能的人蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的具有抑癌功能的蛋白多肽，它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性(a)编码上述的具有抑癌功能的蛋白多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18的编码区序列或全长序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有抑癌功能的蛋白活性的多肽的制备方法，该方法包含(a)在适合表达具有抑癌功能的蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有抑癌功能的蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的具有抑癌功能的蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的具有抑癌功能的蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本发明采用大规模cDNA克隆转染癌细胞，在获得具有抑癌作用的基础上，经测序证明为新的基因，进一步得到全长cDNA克隆。DNA转染试验证明，本发明的具有抑癌功能的蛋白对癌细胞(肝癌细胞)具有抑制克隆形成的作用，其抑制率在50％或50％以上。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的具有抑癌功能的蛋白或多肽”是指具有抑癌功能的蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化具有抑癌功能的蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。具有抑癌功能的蛋白多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有抑癌功能的人蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然具有抑癌功能的人蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(ⅰ)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ⅱ)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ⅲ)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。以PP2703蛋白(在本申请中，蛋白质的命名采用其克隆编号)为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ IDNO:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。以PP3227蛋白(在本申请中，蛋白质的命名采用其克隆编号)为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:6所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:5的蛋白质，但与SEQ ID NO:6所示的编码区序列有差别的核酸序列。对于其他具有抑癌功能的蛋白，可依此类推。对于其他具有抑癌功能的蛋白，可依此类推。
编码成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。
编码具有抑癌功能的蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时，DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时，DNA序列的直接化学合成是不可能的，选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定具有抑癌功能的蛋白的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2kb之内，较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测具有抑癌功能的蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或具有抑癌功能的蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的具有抑癌功能的蛋白多肽(Science,1984；224:1431)。一般来说有以下步骤(1)．用本发明的编码具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)．在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3)．从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，具有抑癌功能的人蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et a1.Gene,1987,56:125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含具有抑癌功能的人蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,coldSpring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的具有抑癌功能的人蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗具有抑癌功能的蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗具有抑癌功能的蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如，抗体可用于激活或抑制具有抑癌功能的人蛋白的功能。用表达的重组具有抑癌功能的人蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激具有抑癌功能的人蛋白功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)具有抑癌功能的人蛋白的药剂的方法。激动剂提高具有抑癌功能的人蛋白刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达具有抑癌功能的人蛋白的膜制剂与标记的具有抑癌功能的人蛋白一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂可以与具有抑癌功能的人蛋白结合并消除其功能，或是抑制具有抑癌功能的人蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将具有抑癌功能的蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响具有抑癌功能的蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。
本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。具有抑癌功能的蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的具有抑癌功能的蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
具有抑癌功能的人蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于具有抑癌功能的蛋白的无表达或异常/无活性的具有抑癌功能的蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的具有抑癌功能的蛋白，以抑制内源性的具有抑癌功能的蛋白活性。例如，一种变异的具有抑癌功能的蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的具有抑癌功能的蛋白，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗具有抑癌功能的蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将具有抑癌功能的蛋白基因转移至细胞内。构建携带具有抑癌功能的蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组具有抑癌功能的人蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制具有抑癌功能的人蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析。
本发明还提供了针对具有抑癌功能的人蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
抗具有抑癌功能的人蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的具有抑癌功能的人蛋白。
与具有抑癌功能的人蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与具有抑癌功能的人蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断具有抑癌功能的人蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如具有抑癌功能的人蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭具有抑癌功能的人蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用具有抑癌功能的人蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
具有抑癌功能的人蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature,1975,256:495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.PatNo.4946778)也可用于生产抗具有抑癌功能的人蛋白的单链抗体。
能与具有抑癌功能的人蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对具有抑癌功能的人蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测具有抑癌功能的人蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的具有抑癌功能的人蛋白水平，可以用作解释具有抑癌功能的人蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断具有抑癌功能的蛋白起作用的疾病。
具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用于具有抑癌功能的蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用于检测具有抑癌功能的蛋白的表达与否或在疾病状态下具有抑癌功能的蛋白的异常表达。如具有抑癌功能的蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断具有抑癌功能的蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用具有抑癌功能的蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测具有抑癌功能的蛋白的转录产物。
检测具有抑癌功能的蛋白基因的突变也可用于诊断具有抑癌功能的蛋白相关的疾病。具有抑癌功能的蛋白突变的形式包括与正常野生型具有抑癌功能的蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomes:a Manual of BasicTechniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
本发明的具有抑癌功能的蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
此外，由于本发明的具有抑癌功能的蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:cDNA基因的获得及对癌细胞克隆形成的抑制作用PP2703,PP3227,PP3564,PP3686,PP3774,PP3781是通过用常规方法构建人胎盘cDNA文库而获得的。取3、6、10月龄的胎盘组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯kit(pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文库构建kit(Seratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-SuperscriptⅡ(GIBCO BRL)，反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受细胞，获得了1×106cfu/μg cDNA滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆，其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针，杂交筛选cDNA文库，挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提kit，按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染肝癌细胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后，加6μl H2O溶解，待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液，混匀后，室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液，均分加入3孔生长于96孔板的7721细胞中，37℃放置2小时，每孔再加50μl无血清培液，37℃24小时。每孔换100μl全培液，37℃24小时，换含G418的全培液100μl,37℃ 24～48小时，边观察，边换G418浓度不等的培液。约2～3次后，直到镜检细胞有克隆形成，计数。发现以上克隆有抑制细胞克隆形成作用，结果如下表所示。
cDNA克隆转染细胞(7721)克隆形成情况
对cDNA克隆采用双脱氧终止法，在ABI377 DNA自动测序仪上测定其一端近500bp的核苷酸序列。分析后，确定为新基因克隆，进行另一端测序，仍未获得全长cDNA序列，设计引物，再次进行测序，直到获得全长序列(SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16)。
实施例2从胎盘cDNA中PCR获得全长基因取3、6、10月龄的胎盘组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-SuperscriptⅡ(GIBCO BRL)反转录酶在42℃进行反转录反应，获得胎盘cDNA。利用各个基因的转异引物(如下表所示)，按90℃ 3分钟1个循环；94℃ 30秒，60℃30秒，72℃ 1分钟，共35个循环；72℃ 10分钟，1个循环进行PCR扩增，获得含有完整开放阅读框序列的各蛋白基因的扩增产物。扩增产物经测序验证，与实施例1测得的序列相符，随后用常规技术将扩增产物转入宿主细胞，获得重组蛋白。
基因特异引物
实施例3:cDNA克隆序列分析1．PP2703A核苷酸序列PP2703(SEQ ID NO:1)长度2518bp1 GGGATTTTCT GCTCCGGTTG GTGAGCGCGC CTGCGCGTTG ACGGCGATTT51 TGCGTTCTGA GGCTGCAGCG TCGGCATCTT GAGCTGCCGG TTCGCGAGTT101 CGAGGCCAGG TTCCGCCTGT CGTGGGTTCG CACCCCGGAC GCGATGCTAT151 TCGACAAGGT GAAAGCGTTC TCGGTGCAGT TGGACGGCGC GACCGCGGGC201 GTCGAGCCCG TGTTTAGCGG CGGCCAGGCC GTGGCGGGCC GGGTGCTGCT251 GGAGCTGTCA AGCGCCGCGC GTGTGGGTGC CCTGAGGCTG CGCGCGCGGG301 GCCGCGCCCA CGTGCACTGG ACCGAGTCGC GCAGCGCGGG CTCGAGCACG351 GCTTACACGC AGAGCTACAG TGAACGCGTG GAGGTCGTGA GCCACCGCGC401 CACGCTCCTG GCGCCAGATA CCGGGGAGAC CACGACGCTG CCTCCTGGGC451 GCCATGAGTT CCTGTTCAGC TTCCAGCTGC CCCCGACCCT GGTGACATCC501 TTCGAGGGCA AACACGGTAG TGTCCGCTAC TGTATCAAGG CCACCCTGCA551 CCGGCCCTGG GTCCCAGCAC GCCGGGCAAG GAAGGTGTTC ACTGTCATCG601 AGCCTGTGGA CATCAACACG CCAGCCCTGC TGGCACCTCA AGCGGGGGCT651 CGGGAAAAGG TTGCCCGATC CTGGTACTGT AACCGTGGCC TAGTCTCCCT701 TTCGGCCAAG ATCGACCGCA AGGGCTACAC CCCAGGAGAG GTCATCCCTG751 TCTTTGCCGA GATCGACAAC GGCTCCACAC GTCCTGTGCT GCCTCGGGCA801 GCCGTGGTGC AGACACAGAC GTTCATGGCC CGAGGCGCCC GAAAGCAGAA851 ACGGGCAGTG GTGGCCAGCC TCGCGGGCGA GCCGGTGGGC CCCGGGCAGC901 GGGCGCTGTG GCAGGGCCGG GCACTGCGGA TCCCCCCAGT GGGTCCTTCC951 ATCCTGCACT GCCGCGTTCT ACACGTGGAC TACGCACTCA AGGTCTGTGT1001 GGATATCCCA GGAACGTCCA AGCTGCTGCT GGAGCTGCCA CTGGTGATCG1051 GCACCATTCC CTTGCACCCT TTTGGCAGCC GTTCCTCCAG CGTGGGCAGC1101 CACGCCAGCT TCCTGCTGGA CTGGAGGCTG GGGGCCTTGC CGGAGCGGCC1151 TGAGGCTCCT CCTGAGTACT CGGAGGTGGT AGCCGACACT GAGGAGGCAG1201 CCTTGGGGCA GAGCCCCTTC CCGCTTCCGC AGGACCCCGA CATGAGCCTT1251 GAAGGCCCGT TCTTCGCCTA CATCCAAGAG TTCCGCTACC GCCCGCCACC1301 CCTGTACTCT GAGGAGGATC CAAACCCACT CTTGGGGGAC ATGAGGCCGC1351 GCTGCATGAC TTGCTGAACG GCACAGGGAC CCCTCGAGGA ACAAGGTTGC1401 ACACCAGCTT TCAGCCACCA TGACTGTGGG GAGTGGCTGG ACCAAGGGCT1451 GACCTCCCCG ACTGCATCAA AGTTGGGGAA CCAAGTCTCA GAGTGAGGCG1501 GGGGCCTTTC GGATATCACA TGGGACAGAG GAAGAGCCCG GCTGGAATCT1551 GACTTACCTG GACCGCTGTC CTTGTGAGGC ATTGAATGCC CAGTGCAGTA1601 TCCGAGAGAC TGTTTAATAA CCTGTCTTCC CAGCCAATTG GTGGTGCTGG1651 AATCCCCTAG GAGCCTTCAG TCTGGGAGAA ACAGAGCCAG ACATAGACAG1701 TTCCAGCATC ACAGAACCAG AAGAAGAGAC CTGCAACTGT GAGAGTCCAG1751 ACAGGAAGCA GAGAAGGCGT CCTTGCGGAA AGGGCATTTT AGCTGAGGCT1801 TTGGAGTACG AATAGGAGCT CAGCAGGCAG ACGAATGAGG AATAAAGGTC1851 AGAGAAGGTC AGAGCTGAGT GACGTTTGGA ATCCACCCCG TTTATTGTAG1901 AACTGGGGGT TCAGAGGGCA GGTGCCTCAG AGTTGAGGCC ACACAGTGAG1951 GTCTGGTGGG TGAAAGGACC CAGGAACGAG GCGTTCAGGA AAGCAGGTTG2001 TCAGAGCTAT GTGGAGTCTG TGGGTGGCAG GGGCAGCCGC TCCAGCCTTT2051 GAAGACTTTG AAAGCCAGAG ATTCCTGGCG CAGGCTTGGA CTTCCTGGGA2101 GCTCCTCCAA GTACCCAGGG GCATCAGAGC TGCCTGGGTG TTACATGGCC2151 CAGGGAACCC AGGTTCAGGG TAGGACAGGC AAGACCAGAT ACCCAATGTG2201 CAAAGTGAAA ACACTGGGCT CCCTGTTAAA CGATGAAGAA TTCAAGACAG2251 TGACAGCATT ACGTCACCCC TGGGGACAGA GGTCAGCCTA AGGTGACACA2301 CGGGGACTAC TGTGCTTCCG GAGGCTCCCT GTGTCCTGGA GGAGAAAAGC2351 ATTAGAGGGG GCAGCTGGAC AAGCTCCCAA CTGCAGAGTC CCAGCCCTGG2401 CTGGGGCAGG GCCCCGGCCT GGGACTCAGC ATTTCTGATA TGCCTTAAGA2451 ATTCATTCTG TTTTGTACAA TTATTTTTTA AAAGTAAACG TGTGGAGAAA2501 GAAAAAAAAA AAAAAAAAB．氨基酸序列PP2703(SEQ ID NO:2)长度407个氨基酸1 MLFDKVKAFS VQLDGATAGV EPVFSGGQAV AGRVLLELSS AARVGALRLR51 ARGRAHVHWT ESRSAGSSTA YTQSYSERVE VVSHRATLLA PDTGETTTLP101 PGRHEFLFSF QLPPTLVTSF EGKHGSVRYC IKATLHRPWV PARRARKVFT151 VIEPVDINTP ALLAPQAGAR EKVARSWYCN RGLVSLSAKI DRKGYTPGEV201 IPVFAEIDNG STRPVLPRAA VVQTQTFMAR GARKQKRAVV ASLAGEPVGP251 GQRALWQGRA LRIPPVGPSI LHCRVLHVDY ALKVCVDIPG TSKLLLELPL301 VIGTIPLHPF GSRSSSVGSH ASFLLDWRLG ALPERPEAPP EYSEVVADTE351 EAALGQSPFP LPQDPDMSLE GPFFAYIQEF RYRPPPLYSE EDPNPLLGDM401 RPRCMTCC．核苷酸及氨基酸组合序列克 隆 号PP2703(SEQ ID NO:3)起始编码子144 ATG终止编码子1367 TGA蛋白质分子量 44376.531 GG GAT TTT CTG CTC CGG TTG GTG AGC GCG CCT GCG CGT TGA CGG CGA 4748 TTT TGC GTT CTG AGG CTG CAG CGT CGG CAT CTT GAG CTG CCG GTT CGC 9596 GAG TTC GAG GCC AGG TTC CGC CTG TCG TGG GTT CGC ACC CCG GAC GCG 143144 ATG CTA TTC GAC AAG GTG AAA GCG TTC TCG GTG CAG TTG GAC GGC GCG 1911 Met Leu Phe Asp Lys Val Lys Ala Phe Ser Val Gln Leu Asp Gly Ala 16192 ACC GCG GGC GTC GAG CCC GTG TTT AGC GGC GGC CAG GCC GTG GCG GGC 23917 Thr Ala Gly Val Glu Pro Val Phe Ser Gly Gly Gln Ala Val Ala Gly 32240 CGG GTG CTG CTG GAG CTG TCA AGC GCC GCG CGT GTG GGT GCC CTG AGG 28733 Arg Val Leu Leu Glu Leu Ser Ser Ala Ala Arg Val Gly Ala Leu Arg 48288 CTG CGC GCG CGG GGC CGC GCC CAC GTG CAC TGG ACC GAG TCG CGC AGC 33549 Leu Arg Ala Arg Gly Arg Ala His Val His Trp Thr Glu Ser Arg Ser 64336 GCG GGC TCG AGC ACG GCT TAC ACG CAG AGC TAC AGT GAA CGC GTG GAG 38365 Ala Gly Ser Ser Thr Ala Tyr Thr Gln Ser Tyr Ser Glu Arg Val Glu 80384 GTC GTG AGC CAC CGC GCC ACG CTC CTG GCG CCA GAT ACC GGG GAG ACC 43181 Val Val Ser His Arg Ala Thr Leu Leu Ala Pro Asp Thr Gly Glu Thr 96432 ACG ACG CTG CCT CCT GGG CGC CAT GAG TTC CTG TTC AGC TTC CAG CTG 47997 Thr Thr Leu Pro Pro Gly Arg His Glu Phe Leu Phe Ser Phe Gln Leu 112480 CCC CCG ACC CTG GTG ACA TCC TTC GAG GGC AAA CAC GGT AGT GTC CGC 527113 Pro Pro Thr Leu Val Thr Ser Phe Glu Gly Lys His Gly Ser Val Arg 128528 TAC TGT ATC AAG GCC ACC CTG CAC CGG CCC TGG GTC CCA GCA CGC CGG 575129 Tyr Cys Ile Lys Ala Thr Leu His Arg Pro Trp Val Pro Ala Arg Arg 144576 GCA AGG AAG GTG TTC ACT GTC ATC GAG CCT GTG GAC ATC AAC ACG CCA 623145 Ala Arg Lys Val Phe Thr Val Ile Glu Pro Val Asp Ile Asn Thr Pro 160624 GCC CTG CTG GCA CCT CAA GCG GGG GCT CGG GAA AAG GTT GCC CGA TCC 671161 Ala Leu Leu Ala Pro Gln Ala Gly Ala Arg Glu Lys Val Ala Arg Ser 176672 TGG TAC TGT AAC CGT GGC CTA GTC TCC CTT TCG GCC AAG ATC GAC CGC 719177 Trp Tyr Cys Asn Arg Gly Leu Val Ser Leu Ser Ala Lys Ile Asp Arg 192720 AAG GGC TAC ACC CCA GGA GAG GTC ATC CCT GTC TTT GCC GAG ATC GAC 767193 Lys Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Val Ile Pro Val Phe Ala Glu Ile Asp 208768 AAC GGC TCC ACA CGT CCT GTG CTG CCT CGG GCA GCC GTG GTG CAG ACA 815209 Asn Gly Ser Thr Arg Pro Val Leu Pro Arg Ala Ala Val Val Gln Thr 224816 CAG ACG TTC ATG GCC CGA GGC GCC CGA AAG CAG AAA CGG GCA GTG GTG 863225 Gln Thr Phe Met Ala Arg Gly Ala Arg Lys Gln Lys Arg Ala Val Val 240864 GCC AGC CTC GCG GGC GAG CCG GTG GGC CCC GGG CAG CGG GCG CTG TGG 911241 Ala Ser Leu Ala Gly Glu Pro Val Gly Pro Gly Gln Arg Ala Leu Trp 256912 CAG GGC CGG GCA CTG CGG ATC CCC CCA GTG GGT CCT TCC ATC CTG CAC 959257 Gln Gly Arg Ala Leu Arg Ile Pro Pro Val Gly Pro Ser Ile Leu His 272960 TGC CGC GTT CTA CAC GTG GAC TAC GCA CTC AAG GTC TGT GTG GAT ATC1007273 Cys Arg Val Leu His Val Asp Tyr Ala Leu Lys Val Cys Val Asp Ile 2881008 CCA GGA ACG TCC AAG CTG CTG CTG GAG CTG CCA CTG GTG ATC GGC ACC1055289 Pro Gly Thr Ser Lys Leu Leu Leu Glu Leu Pro Leu Val Ile Gly Thr 3041056 ATT CCC TTG CAC CCT TTT GGC AGC CGT TCC TCC AGC GTG GGC AGC CAC1103305 Ile Pro Leu His Pro Phe Gly Ser Arg Ser Ser Ser Val Gly Ser His 3201104 GCC AGC TTC CTG CTG GAC TGG AGG CTG GGG GCC TTG CCG GAG CGG CCT1151321 Ala Ser Phe Leu Leu Asp Trp Arg Leu Gly Ala Leu Pro Glu Arg Pro 3361152 GAG GCT CCT CCT GAG TAC TCG GAG GTG GTA GCC GAC ACT GAG GAG GCA1199337 Glu Ala Pro Pro Glu Tyr Ser Glu Val Val Ala Asp Thr Glu Glu Ala 3521200 GCC TTG GGG CAG AGC CCC TTC CCG CTT CCG CAG GAC CCC GAC ATG AGC1247353 Ala Leu Gly Gln Ser Pro Phe Pro Leu Pro Gln Asp Pro Asp Met Ser 3681248 CTT GAA GGC CCG TTC TTC GCC TAC ATC CAA GAG TTC CGC TAC CGC CCG1295369 Leu Glu Gly Pro Phe Phe Ala Tyr Ile Gln Glu Phe Arg Tyr Arg Pro 3841296 CCA CCC CTG TAC TCT GAG GAG GAT CCA AAC CCA CTC TTG GGG GAC ATG1343385 Pro Pro Leu Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asn Pro Leu Leu Gly Asp Met 4001344 AGG CCG CGC TGC ATG ACT TGC TGA ACG GCA CAG GGA CCC CTC GAG GAA1391401 Arg Pro Arg Cys Met Thr Cys *** 4081392 CAA GGT TGC ACA CCA GCT TTC AGC CAC CAT GAC TGT GGG GAG TGG CTG14391440 GAC CAA GGG CTG ACC TCC CCG ACT GCA TCA AAG TTG GGG AAC CAA GTC14871488 TCA GAG TGA GGC GGG GGC CTT TCG GAT ATC ACA TGG GAC AGA GGA AGA15351536 GCC CGG CTG GAA TCT GAC TTA CCT GGA CCG CTG TCC TTG TGA GGC ATT15831584 GAA TGC CCA GTG CAG TAT CCG AGA GAC TGT TTA ATA ACC TGT CTT CCC16311632 AGC CAA TTG GTG GTG CTG GAA TCC CCT AGG AGC CTT CAG TCT GGG AGA16791680 AAC AGA GCC AGA CAT AGA CAG TTC CAG CAT CAC AGA ACC AGA AGA AGA17271728 GAC CTG CAA CTG TGA GAG TCC AGA CAG GAA GCA GAG AAG GCG TCC TTG17751776 CGG AAA GGG CAT TTT AGC TGA GGC TTT GGA GTA CGA ATA GGA GCT CAG18231824 CAG GCA GAC GAA TGA GGA ATA AAG GTC AGA GAA GGT CAG AGC TGA GTG18711872 ACG TTT GGA ATC CAC CCC GTT TAT TGT AGA ACT GGG GGT TCA GAG GGC19191920 AGG TGC CTC AGA GTT GAG GCC ACA CAG TGA GGT CTG GTG GGT GAA AGG19671968 ACC CAG GAA CGA GGC GTT CAG GAA AGC AGG TTG TCA GAG CTA TGT GGA20152016 GTC TGT GGG TGG CAG GGG CAG CCG CTC CAG CCT TTG AAG ACT TTG AAA20632064 GCC AGA GAT TCC TGG CGC AGG CTT GGA CTT CCT GGG AGC TCC TCC AAG21112112 TAC CCA GGG GCA TCA GAG CTG CCT GGG TGT TAC ATG GCC CAG GGA ACC21592160 CAG GTT CAG GGT AGG ACA GGC AAG ACC AGA TAC CCA ATG TGC AAA GTG22072208 AAA ACA CTG GGC TCC CTG TTA AAC GAT GAA GAA TTC AAG ACA GTG ACA22552256 GCA TTA CGT CAC CCC TGG GGA CAG AGG TCA GCC TAA GGT GAC ACA CGG23032304 GGA CTA CTG TGC TTC CGG AGG CTC CCT GTG TCC TGG AGG AGA AAA GCA23512352 TTA GAG GGG GCA GCT GGA CAA GCT CCC AAC TGC AGA GTC CCA GCC CTG23992400 GCT GGG GCA GGG CCC CGG CCT GGG ACT CAG CAT TTC TGA TAT GCC TTA24472448 AGA ATT CAT TCT GTT TTG TAC AAT TAT TTT TTA AAA GTA AAC GTG TGG24952496 AGA AAG AAA AAA AAA AAA AAA AA 25182．PP3227A核苷酸序列PP3227(SEQ ID NO:4)长度1384bp1 ATCAACATTG TCTGTAATTC AGCTTATGTT GTAAACGTAG CCAGTCACAT51 TCACATGGAA ACTGCTACAG TTAAAAGTAC ACTAGACCCA GAACTGCTTA101 ATTTGTTTCA CTTATTCTCA AATGCTGCAT GCTACATGCC AAACAGGTGA151 GACAGCTGGT CATGTACAGT GACATTGTCT GTCATCATTT GCTCATATGG201 GGATACTTAA ACAATTAAAA ACTGACAATG GACTCGCTTA TACTAGTCAT251 GCTTTTCAAA ATTTCTTATA GCTTTGGGCT ATAACCCATA AAATTGGAAT301 TCCTTATAAT CCTAAAGGAC AAGGCATTGT AGAGCAGGCA CATTGAACAT351 TACAACACAT GTTGAAAAGA CGAAAGGGGT ATAGGAGGCC AACTACCACC401 TCAATCAAAA CTACATTTAG CCTTATTTAC TTCACATTTT TGGACTCCTG451 GTACAGATGG TAAGACTCCA GCAGAAAGAC ATTGGCAAGT GTTAGAGGAA501 AAGAGGAAAG TTTATCTGAA AGCATTATGG AAATCCCTGG AAGGACAATG551 GAAAGGTTGG GTGGATTTAC TGACGTGGAG AAGAGGGTAT GCTTGTGTTT601 TCACAGGAGA TGGACAAGCC GTGTGGGTGC CCTCAAGGTG TGTGCAACCA651 TGGAATGGGA GACTGGAGGA ACCCAGGGTG GCCAACCATG GGTCCGGTCC701 CTCTGGTGTG AGCCATGAGC CAGCTGAGCC TGAGTGCGAA GACGGAGAGA751 AGGCCGACCA CAGTCATGAC ATCAACCCCC ATAACCTGGG GACAACTCAA801 GAAAACCACA CAGGAGGCTG AGAAACTACT GGAGCACCAG GGACAGTCTG851 TAAAGTTGGA TGGACCACCA ATGGGAAAAT GAGAGCTGCC CACCCTGGCC901 TTACACTCCT TCAATTAATA CATAAACAGA AAGGAGGATA TACAGAGAGC951 CAAAGGCCCA TGGGACGTGA CCAACATTCC ACTGAGTCTA TACGATCAAA1001 CAGCAAACTG TTTATCATGA ATACAGAATG TGGGCAAACT CATGACTGTG1051 CCTGCCCCAG AAGGTTTGCT GAGGGCAATT GCTTCCTGAC GCCAAGCTCC1101 TTGAGGTTAT CTATTGGGAC ATCCAGAGAA TGCAGTCTTG CAAGCCTACT1151 CTGGACCGAG CAGCTGACCC CCTCTTCCAC TTCCCTTCAC ACTATCTCTT1201 TTGCCTAATA AATACGGAAG GCTGTGTACA AGGTCAGGTC CCTTGTCCAC1251 TAGAGGCAAG GTGCTTCCTG ACCCTTCTTC CAAATATAAA AAAAAAAAAA1301 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA1351 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAB．氨基酸序列PP3227(SEQ ID NO:5)长度109个氨基酸1 MRAAHPGLTL LQLIHKQKGG YTESQRPMGR DQHSTESIRS NSKLFIMNTE51 CGQTHDCACP RRFAEGNCFL TPSSLRLSIG TSRECSLASL LWTEQLTPSS101 TSLHTISFAC．核苷酸及氨基酸组合序列克 隆 号 PP3227(SEQ ID NO:6)起始编码子 879 ATG终止编码子1208 TAA蛋白质分子量12067.061 AT CAA CAT TGT CTG TAA TTC AGC TTA TGT TGT AAA CGT AGC CAG TCA 4748 CAT TCA CAT GGA AAC TGC TAC AGT TAA AAG TAC ACT AGA CCC AGA ACT 9596 GCT TAA TTT GTT TCA CTT ATT CTC AAA TGC TGC ATG CTA CAT GCC AAA143144 CAG GTG AGA CAG CTG GTC ATG TAC AGT GAC ATT GTC TGT CAT CAT TTG191192 CTC ATA TGG GGA TAC TTA AAC AAT TAA AAA CTG ACA ATG GAC TCG CTT239240 ATA CTA GTC ATG CTT TTC AAA ATT TCT TAT AGC TTT GGG CTA TAA CCC287288 ATA AAA TTG GAA TTC CTT ATA ATC CTA AAG GAC AAG GCA TTG TAG AGC335336 AGG CAC ATT GAA CAT TAC AAC ACA TGT TGA AAA GAC GAA AGG GGT ATA383384 GGA GGC CAA CTA CCA CCT CAA TCA AAA CTA CAT TTA GCC TTA TTT ACT431432 TCA CAT TTT TGG ACT CCT GGT ACA GAT GGT AAG ACT CCA GCA GAA AGA479480 CAT TGG CAA GTG TTA GAG GAA AAG AGG AAA GTT TAT CTG AAA GCA TTA527528 TGG AAA TCC CTG GAA GGA CAA TGG AAA GGT TGG GTG GAT TTA CTG ACG 575576 TGG AGA AGA GGG TAT GCT TGT GTT TTC ACA GGA GAT GGA CAA GCC GTG 623624 TGG GTG CCC TCA AGG TGT GTG CAA CCA TGG AAT GGG AGA CTG GAG GAA 671672 CCC AGG GTG GCC AAC CAT GGG TCC GGT CCC TCT GGT GTG AGC CAT GAG 719720 CCA GCT GAG CCT GAG TGC GAA GAC GGA GAG AAG GCC GAC CAC AGT CAT 767768 GAC ATC AAC CCC CAT AAC CTG GGG ACA ACT CAA GAA AAC CAC ACA GGA 815816 GGC TGA GAA ACT ACT GGA GCA CCA GGG ACA GTC TGT AAA GTT GGA TGG 863864 ACC ACC AAT GGG AAA ATG AGA GCT GCC CAC CCT GGC CTT ACA CTC CTT 9111 Met Arg Ala Ala His Pro Gly Leu Thr Leu Leu 11912 CAA TTA ATA CAT AAA CAG AAA GGA GGA TAT ACA GAG AGC CAA AGG CCC 95912 Gln Leu Ile His Lys Gln Lys Gly Gly Tyr Thr Glu Ser Gln Arg Pro 27960 ATG GGA CGT GAC CAA CAT TCC ACT GAG TCT ATA CGA TCA AAC AGC AAA100728 Met Gly Arg Asp Gln His Ser Thr Glu Ser Ile Arg Ser Ash Ser Lys 431008 CTG TTT ATC ATG AAT ACA GAA TGT GGG CAA ACT CAT GAC TGT GCC TGC105544 Leu Phe Ile Met Asn Thr Glu Cys Gly Gln Thr His Asp Cys Ala Cys 591056 CCC AGA AGG TTT GCT GAG GGC AAT TGC TTC CTG ACG CCA AGC TCC TTG110360 Pro Arg Arg Phe Ala Glu Gly Asn Cys Phe Leu Thr Pro Ser Ser Leu 751104 AGG TTA TCT ATT GGG ACA TCC AGA GAA TGC AGT CTT GCA AGC CTA CTC115176 Arg Leu Ser Ile Gly Thr Ser Arg Glu Cys Ser Leu Ala Ser Leu Leu 911152 TGG ACC GAG CAG CTG ACC CCC TCT TCC ACT TCC CTT CAC ACT ATC TCT119992 Trp Thr Glu Gln Leu Thr Pro Ser Ser Thr Ser Leu His Thr Ile Ser 1071200 TTT GCC TAA TAA ATA CGG AAG GCT GTG TAC AAG GTC AGG TCC CTT GTC1247108 Phe Ala *** 1101248 CAC TAG AGG CAA GGT GCT TCC TGA CCC TTC TTC CAA ATA TAA AAA AAA12951296 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA13431344 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA 13843．PP3564A核苷酸序列(SEQ ID NO:7)长度1009bp1 GTTCAAGTGT TAGAATGGAG AGCTGGAGTT CGTTCAGAAT AGTGCTGTGT51 GTTACCACGT CTCCCCTGCA CCCCATTCCT ACCTTGTAGC TCATGACCAT101 TGTGTATAGC ATTTCTACAC TTTGTTTCTT GGTCCTTGGC AATAAAAAGA151 ATGATCTCCC TGAGCCTTTG ACCCCAGATA AACCCCTCCC AATTAATGCA201 TTTTCATTTC CTACTGATAC AAGGCCTGGA GAGGGCTGTT GGGGGCCCTC251 AGGGAGGGTT CAACTCTGAG ACGAGAACTG CCTTGGTGAA GGCAAGTTCA301 AGCACCACTT GAGACTGGGG GCAGCATGGA GTAGGGCAGG GCTACGGGGA351 TACACGGTGC ACCCTGCAAC TTATACCTGA GCCCAGTACA ACAAAGGTGA401 CGGGTGGTGT AGGTACACAC CCAGAGATGG AGCACTGCAG ATCAGCAACC451 TCAGCCCCAC CTGGGAATTC GCTGGAAATG CAGGCTCAAG CCCCTCCCCA501 CACCTGGTGA ATGAGAGAGC CCCAGCCTGA CCCAAGCCCA GGGCGACTCC551 CATACCCTGA AGCCTGGGGC ATGCTGGGCA GCACCGGTGC CCAAATCTGG601 CTGGTGGACA GAAGCACCTG GAGAGTTGGA GAGCTTTTTA AAAAGACATC651 TCTCAGCACT TCCCTCTCTG CAGATTCTGA CTCAATTAAA GAATATCTCC701 TCCAGGTGTG GTGGCTCACA CCTGTAATCC CAGCACTTTG GGAAGCCGAG751 GTGGATGGAC CACGATGTCA GGAGTTCAAG ACCAGCCTGG CCAACATGGT801 GAAACCCCAT CTCTCCTAAA GATACAAAAA AAATTAGCCA GGCGTGGCAG851 TGGGCGCCTG TAATCCCAGC TACTCAGGAG ACTGAGGCAG AGAATTGCTT901 GAAGCCAGAG GCAGAGGTTG CAATGAGCCG GGATCACGCC ACTGAACTCC951 AGCCTGGGTG ACAGAGTGAG ACTCTTGTCT CCAAAAAAAA AAAAAAAAAA1001 AAAAAAAAAB氨基酸序列(SEQ ID NO:8)长度102个氨基酸1 MREPQPDPSP GRLPYPEAWG MLGSTGAQIW LVDRSTWRVG ELFKKTSLST SLSADSDSIK61 EYLLQVWWLT PVIPALWEAE VDGPRCQEFK TSLANMVKPH LSC．核苷酸及氨基酸组合序列克 隆 号PP3564(SEQ ID NO:9)起始编码子511 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++ +LV+ + +VALAL L + +RIE +I +Sbjct:189 TEPIILLTPISFIALVFAIAMAIAVALALTFLFITQLRYVIRNRNGIEDYIRE 2416．PP3781A核苷酸序列(SEQ ID NO:16)长度1431bp1 GTTTCTGGAG TCCTGGGAAG GTGTCTGCCT GGCCGCGCTG CCAGATCAGT51 ACATCTTTTG TAAAAACCCT GAAATGGGCA GGGAAGAAAA CAGGGATTTC101 CCCTCTCTAG ATCCCTGCCA GGTCCCTCTC CAGGAGGCCC CTCTGCTCTC151 CTGAAGGGTG GTCCCTGAGG GTCTGCCCAG CCTTGGCACG AGAGGTTGGT201 TCCAGCCCCT GGCAGGGCTT CCTTCCAAGG GCCCCTGCAG CCTACAAACT251 GGGCCTCGGG CGACTCAAAA TAAGTGCTCT TGGGGGTGGC TCTACCCCAT301 TACCTCCCCG AGCCACAACT CCTGGCCTTC GACTTCTGGC TGGGTTAGCC351 AGACCCTGGT TTCTCTACCC TGATGTTGCA TGAGACCTGG TAACAGTGTC401 TCCCTCCCAG CTCCTTGCCA AAGCCTCTGT TGAGACCTGG GCTTCTTGTA451 GCCCCTTCTC CCTCTGGCCA GCTGCACAGC CTGTGGGAGG TGCCCGGCCC501 AGGCTGGGTG TGGGGGAAGC TGGTCCCTGC TGTGGGTGGC GCTGGGGACC551 TAGGGGCTCC TTCTGAGGTT GGCCTTGTGG CTCTGGGCTG TATGCCTCTG601 GGGTGTAGGG AAGAGGCGGG AGGAGTCATG GGGATGGGGA GCGGCAAGGG651 GGAGAGAGGG GCCCTCGACA AAGGCTTGGG AAATGAGGGG AGGTGGAGGC701 AGGGCAGGGG AAGCGAAGAG TCAGCCTTGG AGAGAGCACC CTGGGGCCTC751 CGTGTCGGGG TACACCCAGC ACTTTGCGAC CTGCGGCCCA GCAGGCGCGG801 AGGATGGCGG GGAGGAAGCC AGCAGCCCCT GTGTTTACTG TCGTCAGAAA851 GGTCTTGTGT TTTGGTTTTG GGGTTTTTGT TTTGTTTGTG TTTTGTTTGG901 CTTGTTTGTT TTTTAAGGGG AAAAAAGTTT GTAATTATTT CATCCAAATC951 TCCCGTTATA TATCTGTGAA TAATAAGAGA TTTTATAATA GCAAGAAAAT1001 GATGTATATT TTAGTTTGTT GACAAATAAG TCATCATGAT CACGAAGGAC1051 ACTGAGAAAA AAATAATTTA GAACCCTGGT TTTTGTGAAT TTTTTTGTTT1101 TGTGTTTCTT TGTTTTGAGA TTTGTGTTTG GTTTGGTTTT TGCACTGCAC1151 TAAGGCAGGA GGGTTGGAGG GCTGGGTGCA GCCTGGGAGT CCGATGGTTT1201 TCAGCAGGAG ACGGGGTGTC CCCTGCAGGG GGCTAAACTG CAGGGGCCTG1251 AGATTAGCTG TGAACATGTG GGAGCCCGAT GCATGTGGGT CAGGGATCTG1301 GGGGCCCCCC CAGCTGGCGG GAACCCCAAA TGGACACAAA CTGTACATTT1351 GCCAATGGGT TTTTTTTCAG ACCATGGTTT TTACTTGCAA ATAAACCTGA1401 GTTTCTTTTC TGCAAAAAAA AAAAAAAAAA AB氨基酸序列(SEQ ID NO:17)长度125个氨基酸1 MPLGCREEAG GVMGMGSGKG ERGALDKGLG NEGRWRQGRG SEESALERAP WGLRVGVHPA61 LCDLRPSRRG GWRGGSQQPL CLLSSERSCV LVLGFLFCLC FVWLVCFLRG KKFVIISSKS121 PVIYLC．核苷酸及氨基酸组合序列克 隆 号 PP3781(SEQ ID NO:18)起始编码子 592 ATG终止编码子969 TGA蛋白质分子量135961 GTT TCT GGA GTC CTG GGA AGG TGT CTG CCT GGC CGC GCT GCC AGA TCA 4849 GTA CAT CTT TTG TAA AAA CCC TGA AAT GGG CAG GGA AGA AAA CAG GGA 9697 TTT CCC CTC TCT AGA TCC CTG CCA GGT CCC TCT CCA GGA GGC CCC TCT 144145 GCT CTC CTG AAG GGT GGT CCC TGA GGG TCT GCC CAG CCT TGG CAC GAG 192193 AGG TTG GTT CCA GCC CCT GGC AGG GCT TCC TTC CAA GGG CCC CTG CAG 240241 CCT ACA AAC TGG GCC TCG GGC GAC TCA AAA TAA GTG CTC TTG GGG GTG 288289 GCT CrA CCC CAT TAC CTC CCC CAG CCA CAA CTC CTG GCC TTC GAC TTC 336337 TGG CTG GGT TAG CCA GAC CCT GGT TTC TCT ACC CTG ATG TTG CAT GAG 384385 ACC TGG TAA CAG TGT CTC CCT CCC ACC TCC TTG CCA AAG CCT CTG TTG 432433 AGA CCT GGG CTT CTT GTA GCC CCT TCT CCC TCT GGC CAG CTG CAC ACC 480481 CTG TGG GAG GTG CCC GGC CCA GGC TGG GTG TGG GGG AAG CTG GTC CCT 528529 GCT GTG GGT GGC GCT GGG GAC CTA GGG GCT CCT TCT GAG GTT GGC CTT 576577 GTG GCT CTG GGC TGT ATG CCT CTG GGG TGT AGG GAA GAG GCG GGA GGA 6241 Met Pro Leu Gly Cys Arg Glu Glu Ala Gly Gly 11625 GTC ATG GGG ATG GGG AGC GGC AAG GGG GAG AGA GGG GCC CTC GAC AAA 67212 Val Met Gly Met Gly Ser Gly Lys Gly Glu Arg Gly Ala Leu Asp Lys 27573 GGC TTG GGA AAT GAG GGG AGG TGG AGG CAG GGC AGG GGA AGC GAA GAG 72028 Gly Leu Gly Asn Glu Gly Arg Trp Arg Gln Gly Arg Gly Ser Glu Glu 43721 TCA GCC TTG GAG AGA GCA CCC TGG GGC CTC CGT GTC GGG GTA CAC CCA 76844 Ser Ala Leu Glu Arg Ala Pro Trp Gly Leu Arg Val Gly Val His Pro 59769 GCA CTT TGC GAC CTG CGG CCC AGC AGG CGC GGA GGA TGG CGG GGA GGA 81660 Ala Leu Cys Asp Leu Arg Pro Ser Arg Arg Gly Gly Trp Arg Gly Gly 75817 AGC CAG CAG CCC CTG TGT TTA CTG TCG TCA GAA AGG TCT TGT GTT TTG 86476 Ser Gln Gln Pro Leu Cys Leu Leu Ser Ser Glu Arg Ser Cys Val Leu 91865 GTT TTG GGG TTT TTG TTT TGT TTG TGT TTT GTT TGG CTT GTT TGT TTT 91292 Val Leu Gly Phe Leu Phe Cys Leu Cys Phe Val Trp Leu Val Cys Phe 107913 TTA AGG GGA AAA AAG TTT GTA ATT ATT TCA TCC AAA TCT CCC GTT ATA 960108 Leu Arg Gly Lys Lys Phe Val Ile Ile Ser Ser Lys Ser Pro Val Ile 123961 TAT CTG TGA ATA ATA AGA GAT TTT ATA ATA GCA AGA AAA TGA TGT ATA1008124 Tyr Leu *** 1261009 TTT TAG TTT GTT GAC AAA TAA GTC ATC ATG ATC ACG AAG GAC ACT GAG10561057 AAA AAA ATA ATT TAG AAC CCT GGT TTT TGT GAA TTT TTT TGT TTT GTG11041105 TTT CTT TGT TTT GAG ATT TGT GTT TGG TTT GGT TTT TCC ACT CCA CTA11521153 AGG CAG GAG GGT TGG AGG GCT GGG TGC ACC CTG GGA GTC CGA TGG TTT12001201 TCA GCA GGA GAC GGG GTG TCC CCT GCA GGG GGC TAA ACT GCA GGG GCC12481249 TGA GAT TAG CTG TGA ACA TGT GGG AGC CCG ATG CAT GTG GGT CAG GGA12961297 TCT GGG GGC CCC CCC ACC TGG CGG GAA CCC CAA ATG GAC ACA AAC TGT13441345 ACA TTT GCC AAT GGG TTT TTT TTC AGA CCA TGG TTT TTA CTT GCA AAT13921393 AAA CCT GAG TTT CTT TTC TGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA1431在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1．一种分离的具有抑癌功能的人蛋白，其特征在于，它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQID NO:17；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2．如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17。
3．一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17。
5．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18的编码区序列或全长序列。
6．一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7．一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8．一种具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达具有抑癌功能的人蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽。
9．一种能与权利要求1所述的具有抑癌功能的人蛋白特异性结合的抗体。
10．一种核酸分子，它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。
11．一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了一类新的具有抑癌功能的人蛋白,编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病如癌症等的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸的用途。
文档编号C12N15/13GK1323802SQ00115680
公开日2001年11月28日 申请日期2000年5月15日 优先权日2000年5月15日
发明者顾健人, 杨胜利 申请人:上海市肿瘤研究所