专利名称：在芽孢杆菌中表达重组蛋白的发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及芽孢杆菌表达系统，具体涉及分泌重组蛋白的基因工程芽孢杆菌培养条件的优化。
一般来说，利用基因工程手段生产特定的重组蛋白，我们期望目标蛋白能够分泌到胞外。外源蛋白分泌到胞外，避免了外源蛋白在宿主细胞内集聚抑制宿主细胞的生长，和可能给宿主细胞带来的毒害。许多外源蛋白要成为有生物活性的蛋白还需要经过部分的修饰，而这些修饰作用有相当部分是在分泌的过程中进行的。能够从发酵液中直接提取目标产物，避免了破碎细胞和从混杂细胞碎片和内容物的发酵液中提纯产物，对于工业化生产来说，生产效率和成本及目标产物的纯度都将极大地得到优化。
芽孢杆菌表达系统有以下优点1、能够把有功能的蛋白质分泌到胞外，2、非致病性，3、没有明显的偏爱密码子(Harwood，C．R．(ed)，Bacillus，Plenum，New York，1989)。芽孢杆菌对生长环境要求不高，很容易达到较高细胞密度。这些优越性为芽孢杆菌应用于工业化大生产带来了巨大优势。
表达系统确定后，培养基的成分就成为重组蛋白能否达到高表达水平的重要影响因素。生产重组蛋白的培养基可以是合成培养基，或是天然培养基。但都应是液体培养基。一般地，培养基组成成分包括碳源，如葡萄糖；氮源，如酵母膏，蛋白胨，牛肉膏，尿素等；无机盐，如Na+，K+，Mg2，Ca2+，柠檬酸钠等。葡萄糖作为最通用的培养用碳源存在于培养基中。当表达质粒中带有对葡萄糖浓度敏感的启动子，如p43等时，重组蛋白能否达到高表达水平与培养基中葡萄糖的浓度有很密切的关系。高浓度的葡萄糖会产生分解代谢产物阻遏现象，抑制基因表达(Milton H．Saier，Jr．，Biotechnology and Bioengineering 1998；V．58；No．2-3，pp．170-174)。若要消除或降低其副面影响，只有在发酵过程中采用低浓度流加葡萄糖的工艺，这就需要增加人力，物力来监测葡萄糖浓度，控制流加速度，成本和人工的耗费对工业化扩大生产是不利的。
因此，在发酵培养基中采用其它碳源的成分来代替葡萄糖以改进发酵工艺，提高重组蛋白的表达量及生产率的研究工作，是很有实用意义的。
为此，本发明的目的是提供一种在芽孢杆菌中表达重组蛋白的发酵工艺，其中在发酵培养基中采用淀粉作为主要碳源的成分，可以大大提高重组蛋白的生产率。
本发明提供一种在芽孢杆菌中表达重组蛋白的发酵工艺，其中在发酵培养基中通用的葡萄糖以另一种价廉方便的碳源淀粉代替。在整个培养过程中，淀粉不断为枯草杆菌分泌的胞外酶分解成为寡糖片段，为菌体吸收利用，成为一种天然，无需调控的流加系统，不仅免除了人工流加碳源的繁琐工艺，而且菌体的生长和表达水平均有很大的提高。
本发明所述宿主菌芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌等。由于本发明发酵培养基中采用淀粉代替葡萄糖，因此，可适用于表达质粒中带有如p43，HpaII等对葡萄糖敏感的启动子。
本发明在芽孢杆菌中表达重组蛋白的发酵工艺，特别适用于发酵罐水平的发酵工艺。发酵工艺包括三个步骤a．一级种子培养将液氮保存的菌种接种至3mlLB培养基中培养，培养液涂划LB琼脂平板至出现清晰单菌落，挑取一个单菌落接入3mlLB培养基中培养。
b．二级种子培养将一级种子培养液接入50mlLB培养基中培养。
c．发酵罐培养将二级种子培养液接入1L发酵培养基中，在发酵罐中培养，发酵过程控制参数如下温度25-40℃；pH5．0-8．5；通气量0．2-1．6L／min；搅拌速率250-950r／min；溶氧控制在15-30％；种子接种量为1-10％。
在发酵罐培养流程中用的发酵培养基采用淀粉作为主要碳源的成分。发酵培养基的组成如下所示组分份(重量)蛋白胨 1-30酵母膏 1-30柠檬酸钠0．1-5K2HPO41-5淀粉5-100将以上各组分混合，加水至重量1000份，高压灭菌。
在下面本发明基于中国专利申请CN 99113885．6中报道的青霉素G酰化酶(penicillin acylase，EC 3．5．1．11简称PGA)作为重组蛋白的一例，采用表达PGA的枯草芽孢杆菌基因工程菌株pga-SIBAS205，阐述通过优化带有重组蛋白基因的枯草杆菌菌株的生长及表达条件来提高重组蛋白的生产率。
实验结果表明利用淀粉作为培养基中的主要碳源可以大大提高细胞密度和重组蛋白产量，而且淀粉在培养基中的浓度不会对细胞生长和重组蛋白的分泌构成影响。与之相比，重组蛋白的分泌对培养基中存在的葡萄糖浓度十分敏感，较高浓度的葡萄糖会引起分解代谢产物阻遏而抑制重组蛋白的分泌。表1列出不同碳源对PGA分泌量的影响(重组细胞在含有或不含碳源的LB培养基中，37℃生长48小时)。
表1不同碳源对PGA分泌量的影响
*和**参见表2中的附注培养基中淀粉的浓度范围5g／L-100g／L。在发酵罐水平，淀粉浓度低于30g／L时，随浓度增大，重组蛋白产率增大；而淀粉浓度在30g／L-60g／L之间，重组蛋白的生长及表达已经区别不大。若盲目增大碳源浓度，其结果会使培养基粘稠，影响溶氧水平，对原材料也是一种浪费。
又以青霉素G酰化酶重组蛋白为例，在相同表达系统的不同优化条件下，重组蛋白的表达情况如表2所示。优化后PGA的生产率比优化前提高8．5-9．3倍。
本发明优点中国专利申请CN 99113885．6采用组成型表达的基因工程枯草杆菌作为重组蛋白生产菌，目标蛋白产生速度快，生产菌传代稳定，生产工艺简化，本发明在此基础上，采用淀粉作为发酵培养基中的主要碳源成分，又进一步将重组蛋白的生产效率提高到一个新的水平。而且整个发酵过程条件比较粗放，不需要复杂的控制过程，十分有利于工业化生产应用。
本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例11、菌种枯草芽孢杆菌基因工程菌株pga-SIBAS205(参见CN99113885．6)。
2、培养基(1)种子培养基组成酵母膏 6．25g蛋白胨 10g氯化钠 10g将以上各组分混合，加水至重量1000g，高压灭菌。
(2)发酵培养基组成蛋白胨 15g酵母膏 25g柠檬酸钠 1gK2HPO43g淀粉 30g将以上各组分混合，加水至重量1000g，高压灭菌。
3、发酵(1)种子培养a)一级种子培养液氮保存的菌种接种至3ml试管LB(含卡那霉素10ug／ml)中，37℃，250r／min培养16-18小时。培养液划LB琼脂平板(含卡那霉素10ug／ml)，37℃培养24小时。取灭菌牙签挑取一个单菌落，接入3mlLB培养基中(含卡那霉素10ug／ml)，37℃，250r／min培养16-18小时。
b)二级种子培养将种子液以5％接种量接入含有50ml发酵培养基的250ml摇瓶中，用八层灭菌纱布覆盖瓶口，37℃，250r／min培养16-18小时。
(2)发酵罐培养将二级种子50ml接入含有1L发酵培养基的B．Braun 1．2L全自动发酵罐中培养48小时，pH5．0-8．5。通气量0．2-1．6L／min，搅拌速率250-950r／min。溶氧控制在15-30％。在泡沫较多的情况下，滴加少量消泡剂泡敌。37℃，培养48小时。结果见表2，与优化前相比，优化后菌体密度提高2．39倍，PGA的生产率提高8．5倍。
实施例21、菌种枯草芽孢杆菌基因工程菌株pga-SIBAS205(参见CN99113885．6)。
2、培养基(1)种子培养基组成同实施例1。
(2)发酵培养基组成蛋白胨20g酵母膏20g柠檬酸钠 3gK2HPO44g淀粉 60g将以上各组分混合，加水至重量1000g，高压灭菌。
3、发酵步骤同实施例1。结果见表2，与优化前相比，菌体密度提高2．77倍，PGA的生产率提高9．3倍。
表2 PGA在枯草芽孢杆菌表达系统中不同优化条件下的表达情况
*细胞密度的检测将菌液稀释一定倍数，以蒸馏水为空白对照，测定600nm光密度。使光密度测定值在0．1-0．7之间，再以光密度测定值乘以稀释倍数，即为A600。
**青霉素G酰化酶活力单位U。
青霉素G酰化酶活力测定，采用NIPAB法10μl酶液加入490μl磷酸缓冲液(0．05mol／L，pH 7．5)，37℃温浴。再加入1ml 37℃预热的0．9mg／ml NIPAB溶液(6-硝基-3-苯乙酰胺基苯甲酸)。反应4分钟，加入1ml 95％乙醇终止反应，测定405nm吸光度的变化。
空白对照10μl酶液为磷酸缓冲液代替。
酶活力定义为1分钟内水解产生1μmol的6-硝基-3-氨基-苯甲酸所需青霉素酰化酶的量为1单位。
酶活力计算公式为酶活力浓度(U／ml)=7×A40权利要求
1.一种在芽孢杆菌中表达重组蛋白的发酵工艺，包括一级种子培养，二级种子培养及发酵罐培养三个步骤，其特征在于在发酵罐培养步骤用的发酵培养基中采用淀粉作为主要碳源的成分。
2.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于所述发酵培养基的组成如下组分 份(重量)蛋白胨 1-30酵母膏 1-30柠檬酸钠 0．1-5K2HPO41-5淀粉 5-100将以上各组分混合，加水至重量为1000份。
3.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。
4.如权利要求3所述的发酵工艺，其特征在于所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌。
全文摘要
一种在芽孢杆菌中表达重组蛋白的发酵工艺,采用淀粉作为发酵培养基主要碳源的组分,可以大大提高重组蛋白的生产率。带有重组蛋白基因的枯草芽孢杆菌基因工程菌株生长条件和表达条件在优化条件下,重组蛋白的生产率可以比未优化条件下提高8.5—9.3倍。且培养基成本低廉,发酵工艺简单易行,将之应用于工业生产,具有广阔前景。
文档编号C12P21/00GK1291655SQ0011986
公开日2001年4月18日 申请日期2000年9月1日 优先权日2000年9月1日
发明者杨晟, 黄鹤, 袁中一 申请人:中国科学院上海生物化学研究所